制首烏對(duì)疊氮鈉腦內(nèi)灌流大鼠的腦保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、本研究中選用已證實(shí)有效的劑量的制首烏水煎液進(jìn)行研究。旨在探討制首烏對(duì)疊氮鈉灌流所致的大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿水平下降的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)理。為何首烏作為腦保護(hù)劑治療老年人常見的退行性疾病所致的癡呆提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法：微透析技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腦內(nèi)Ach/Ch水平變化：微透析技術(shù)是利用小分子物質(zhì)能通過半透膜順濃度梯度進(jìn)行擴(kuò)散的原理為基礎(chǔ)進(jìn)行腦內(nèi)采樣的技術(shù)。本研究采用此方法實(shí)現(xiàn)對(duì)清醒自由活動(dòng)大鼠腦內(nèi)細(xì)胞外Ach/Ch水平變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；高效液相色

2、譜-柱后固定化酶反應(yīng)器-電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定微透析透析液中乙酰膽堿和膽堿含量：本研究參考BAS公司ACh/Ch測(cè)試操作手冊(cè)(MF-9053)和文獻(xiàn)報(bào)道的方法，對(duì)微透析收集的透析液進(jìn)行Ach/Ch含量的測(cè)定。方法學(xué)考察顯示，該方法測(cè)定Ach和Ch靈敏可靠；放射性同位素結(jié)合法測(cè)定膽堿乙酰化酶(ChAT)活力；分光光度法測(cè)定膽堿酯酶(AchE)活力；放射性配基-受體結(jié)合法測(cè)定膽堿能M受體及NMDA受體結(jié)合力；分光光度法測(cè)定乳酸(LD)含量。

3、 研究內(nèi)容：腦內(nèi)灌流NaN3120min造成膽堿能神經(jīng)損傷的模型研究。 研究指標(biāo)：透析液中的Ach和Ch含量；灌流結(jié)束后斷頭處死動(dòng)物并取出灌流測(cè)紋狀體，測(cè)定ChAT、AchE、M受體、NMDA受體活性以及LD含量。 數(shù)據(jù)處理：兩組各指標(biāo)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±Sd)表示，均值比較用t檢驗(yàn)。 結(jié)果：Ach水平變化：對(duì)照組在整個(gè)觀察期間，紋狀體Ach水平基本穩(wěn)定，偶有波動(dòng)。模型組在灌流NaN3期間，Ach水平顯著

4、下降；在停灌NaN3后Ach水平停止下降，5.5h之后呈現(xiàn)基本穩(wěn)定、緩慢上升的趨勢(shì)，至14.5h的時(shí)候，已經(jīng)上升到和對(duì)照組比較差異無顯著性意義的水平；Ch水平的變化：對(duì)照組在整個(gè)灌流期間Ch水平基本上很穩(wěn)定。模型組在開始灌流NaN3之后Ch水平就開始急劇上升，在lh時(shí)達(dá)到高峰，之后處于平臺(tái)期；在停止灌流NaN3之后，Ch水平即開始下降，從第4h開始就基本穩(wěn)定下來；其他指標(biāo)的變化：在停灌NaN3后16.5h，模型組紋狀體ChAT活性和膽堿

5、能M受體活性和對(duì)照組比有所降低，但差異無顯著性意義。AchE活性和乳酸含量兩組間很接近。模型組的NMDA受體活性顯著升高。 討論：通過測(cè)定腦內(nèi)ACh的含量可以較可靠的反映腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)的功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示0.2％的NaN3灌流液120min腦內(nèi)微透析灌流使得紋狀體Ach水平下降，并且這種變化是可逆性的，在停止灌流后14.5小時(shí)即恢復(fù)到正常水平。因此，大鼠膽堿能神經(jīng)功能下降的造模是成功的?！　?duì)于神經(jīng)遞質(zhì)的研究，不僅僅只有對(duì)遞

6、質(zhì)本身含量變化的研究，還應(yīng)該對(duì)其受體以及代謝酶作分析，才能比較全面地把握遞質(zhì)系統(tǒng)的改變。本試驗(yàn)結(jié)果未能發(fā)現(xiàn)ChAT、AchE以及M受體活性的改變。乳酸的堆積能反映細(xì)胞線粒體功能障礙，本實(shí)驗(yàn)未能發(fā)現(xiàn)LD含量的明顯變化。這些陰性試驗(yàn)結(jié)果均可能與時(shí)程有關(guān)，即在停灌NaN3后16.5h，這些變化已經(jīng)明顯減輕乃至消失?！　MDA受體被過度激活，引發(fā)興奮性氨基酸毒性，在AD等神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaN3能造成NMDA

7、活性的顯著升高。 小結(jié)：此部分的試驗(yàn)全程觀察了腦內(nèi)灌流0.2％NaN3120min及之后恢復(fù)期的紋狀體Ach和Ch水平的動(dòng)態(tài)變化。試驗(yàn)結(jié)果顯示Ach水平的可逆性下降以及Ch水平的可逆行升高，提示NaN3造成膽堿能神經(jīng)功能下降的動(dòng)物模型成功；其它各指標(biāo)陰性結(jié)果提示在停灌NaN3后16.5h，損傷可能已經(jīng)基本恢復(fù)。結(jié)合Ach和Ch的動(dòng)態(tài)變化情況，擬在下面的藥效及機(jī)制研究中，于停灌NaN3后3.5h處死動(dòng)物取紋狀體，以期觀察到腦內(nèi)相關(guān)

8、指標(biāo)的變化。 本文研究了制首烏對(duì)腦內(nèi)灌流NaN3大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制。 動(dòng)物分組與處理：SD大鼠被隨機(jī)分為5組：制首烏組(15g/Kg)、都可喜組(10mg/Kg)、制首烏+都可喜組(制首烏15g/Kg+10mg/Kg都可喜)，對(duì)照組與模型組(給予等體積蒸餾水)。連續(xù)灌胃給藥14天，于第13天做探陣套管埋植手術(shù)，第二天動(dòng)物清醒后插入探針進(jìn)行微透析。　　微透析方案：探針植入紋狀體中，收集NaN3灌流前、灌流中(2h)

9、、灌流后(恢復(fù)期，3.5h)的透析液，每30分鐘收集一管。 研究指標(biāo)：透析液中的Ach和Ch含量，二者各自的濃度-時(shí)間曲線下面積、極值、極值對(duì)應(yīng)時(shí)間；灌流結(jié)束后斷頭處死動(dòng)物并取出灌流測(cè)紋狀體，測(cè)定ChAT、AchE、M受體、NMDA受體活性以及LD含量。 結(jié)果：Ach水平的變化：對(duì)照組Ach水平在觀察期間基本保持穩(wěn)定，模型組在灌流NaN3期間Ach水平明顯下降；在停止灌流NaN3之后不再繼續(xù)下降，但一直顯著低于對(duì)照組。這

10、個(gè)結(jié)果和前面進(jìn)行的造模試驗(yàn)結(jié)果基本一致。在整個(gè)觀察期間，各給藥組紋狀體細(xì)胞外Ach水平一直高于模型組，其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義的時(shí)間點(diǎn)在制首烏組和都可喜組各有2個(gè)，制首烏+都可喜合用組有7個(gè)。三給藥組之間比較，各時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)差異均無顯著性意義?！　『蛯?duì)照組比較，模型組的Ach濃度-時(shí)間曲線下面積、Ach最小值均顯著低于對(duì)照組，各給藥組和模型組比較，均有升高。但給藥組的Ach最小值對(duì)應(yīng)時(shí)間和模型組大致相同。　　Ch水平的變化：開始灌流Na

11、N3后，模型組大鼠紋狀體細(xì)胞外中Ch含量開始出現(xiàn)顯著升高；在停止灌流NaN3后，Ch水平開始下降，直到停灌3h時(shí)恢復(fù)到和對(duì)照組無明顯差異的水平。在整個(gè)觀察期間，各給藥組紋狀體細(xì)胞外Ch水平一直低于模型組，其中數(shù)據(jù)差異有顯著性意義的時(shí)間點(diǎn)在制首烏組有3個(gè)，都可喜組有6個(gè)，制首烏+都可喜合用組有1個(gè)。三給藥組之間比較，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義，模型組Ch的濃度-時(shí)間曲線下面積和Ch最大值均顯著高于對(duì)照組，各給藥組和模型組比較均有降低。各

12、組之間的Ch最大值對(duì)應(yīng)時(shí)間均大致相同?！　hAT活性變化：模型組ChAT活性明顯低于對(duì)照組，各給藥組ChAT活性均明顯高于模型組?！　chE活性的變化：各組AchE話性相差不大。　　M受體活性變化：模型組比對(duì)照組有所下降，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。和模型組比較，都可喜組和制首烏+都可喜合用組均明顯升高?！　MDA受體活性變化：模型組比對(duì)照組有所升高，但差異不具顯著性意義。與模型組比較，各給藥組均能顯著降低NMDA受體結(jié)合力。

13、　　LD含量變化：各組的乳酸含量相差不大。 討論：以上結(jié)果提示腦內(nèi)灌流NaN3120min，紋狀體的細(xì)胞外Ach水平有顯著下降而Ch水平顯著上升，與前面的造模試驗(yàn)基本一致，表明模型重復(fù)成功。　　三個(gè)給藥組均可不同程度地改善NaN3引起的Ach水平下降，但是制首烏和都可喜主要在灌流NaN3期間顯示這種效果，而二藥合用則在恢復(fù)期也有明顯的改善效果。并且這種改善作用基本上體現(xiàn)在降低這種下降的程度，而不是延遲這種下降。各給藥組均可減

14、輕Ch堆積，提示其改善Ach水平的作用可能與其改善Ch的攝取有關(guān)?！　⊥９郚aN3后的3.5h時(shí)模型組ChAT活性降低，其機(jī)制可能與NaN3造成線粒體功能障礙、導(dǎo)致細(xì)胞功能受損，波及胞體內(nèi)的ChAT有關(guān)。這個(gè)結(jié)果和Ach水平的變化一致，提示NaN3使腦內(nèi)Ach水平下降，與NaN3造成ChAT活性下降有關(guān)；而各給藥組可以提高ChAT活性，提示其改善學(xué)習(xí)記憶的功能與其提高ChAT活性，促進(jìn)Ach合成有關(guān)?！　chE活性變化的結(jié)果并不能

15、確切說明NaN3對(duì)AchE活性沒有影響，而可能是因?yàn)楣嗔饕褐泻行滤沟拿?AchE的可逆性抑制劑)，導(dǎo)致AchE變化被“抹煞”了?！　《伎上埠椭剖诪?都可喜合用均可增高M(jìn)受體活性，從而改善膽堿能神經(jīng)功能。達(dá)到腦保護(hù)、改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用?！　≡谕９郚aN3之后的3.5h，模型組NMDA受體較對(duì)照組升高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義，提示在這個(gè)時(shí)刻N(yùn)aN3造成的影響還沒有太深，可能跟興奮性氨基酸在細(xì)胞損傷到一定程度之后才會(huì)過度釋放有關(guān)。但

16、是各給藥組在此時(shí)已經(jīng)顯示出其抗興奮性氨基酸過度釋放的效果，推測(cè)它們提高腦內(nèi)Ach水平的作用與其抗興奮性氨基酸毒性、保護(hù)腦細(xì)胞有關(guān)?！　⊙芯拷Y(jié)論：0.2％NaN3腦內(nèi)灌流120min可以導(dǎo)致腦內(nèi)Ach水平下降，其機(jī)制可能與Ch攝取障礙引起Ach合成原料減少、ChAT活性降低致Ach合成減少有關(guān)；而ChAT活性下降可能與興奮性氨基酸過度釋放導(dǎo)致細(xì)胞損傷以及NaN3直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙從而影響ChAT活性有關(guān)。這些結(jié)果表明NaN3可以

17、導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)功能障礙?！　≈剖诪跛嵋?15g/Kg)可以通過改善NaN3腦內(nèi)灌流模型大鼠的膽堿能神經(jīng)功能來達(dá)到腦保護(hù)的效果，其機(jī)制為提高腦內(nèi)Ach水平，增強(qiáng)M受體活性，改善膽堿能神經(jīng)功能；提高Ach水平的作用與其提高ChAT活性、改善Ch的攝取有關(guān)；減輕NMDA受體過度激活，降低興奮性氨基酸毒性，保護(hù)細(xì)胞，從而改善Ch攝取和ChAT活性。以上制首烏的作用與都可喜(10mg/Kg)相似，二藥合用效果較單用為好?！　”狙芯渴状螌?duì)0.