亞低溫聯(lián)合EPO對TBI大鼠腦保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究目的:本實驗利用液壓打擊裝置成功建立大鼠顱腦創(chuàng)傷模型，并運(yùn)用此模型進(jìn)行:(1)、給與亞低溫(mild hypothermia，MHT)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)治療后，觀察亞低溫(MHT)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)單獨(dú)及兩者聯(lián)合治療對顱腦創(chuàng)傷大鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦組織含水量、血腦屏障通透性的影響，探索亞低溫(MHT)聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素(EPO)應(yīng)用的腦保護(hù)作用;(2)、給與亞低溫（MHT）、促紅細(xì)胞生

2、成素(EPO)單獨(dú)及兩者聯(lián)合治療后，測定損傷灶周圍腦組織AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3的含量變化，從而探索其與腦保護(hù)作用之間的關(guān)系及聯(lián)合應(yīng)用亞低溫(MHT)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)腦保護(hù)作用的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容與方法:本實驗分為兩個部分:試驗一， MHT聯(lián)合EPO治療的腦保護(hù)作用的研究。實驗二， MHT聯(lián)合EPO治療對顱腦創(chuàng)傷大鼠腦組織中

3、AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3表達(dá)的影響。
　　 試驗一:采用健康成年雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分成5組:假手術(shù)組（Sham組）僅做傷前準(zhǔn)備而不予液壓打擊、常溫治療組(NT組)只致傷不降溫、亞低溫治療組（MHT組）給予亞低溫治療、促紅細(xì)胞生成素治療組（EPO組）與規(guī)定時間給與EPO腹腔注射治療、亞低溫聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素治療組(MHT+EPO組)給與亞低溫治療，并在規(guī)定時間

4、給與EPO腹腔注射治療。術(shù)后48h所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分(n=8)，完畢后所有大鼠斷頭處死，干/濕比重法測定腦組織含水量(n=4);EvanS藍(lán)測定法測定血腦屏障通透性改變(n=4)。
　　 實驗二:采用健康成年雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分成5組:假手術(shù)組（Sham組）僅做傷前準(zhǔn)備而不予液壓打擊、常溫治療組(NT組)只致傷不降溫、亞低溫治療組（MHT組）給予亞低溫治療、促紅細(xì)胞生成素治療組（EPO組）與規(guī)定時間給與EPO

5、腹腔注射治療、亞低溫聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素治療組(MHT+EPO組)給與亞低溫治療，并在規(guī)定時間給與EPO腹腔注射治療。術(shù)后48h所有大鼠斷頭處死，采用HE染色法觀察損傷病灶大小(n=3)，采用蛋白印跡法（WesternBlotting法）(n=3)和實時定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(Real-time qPCR法)(n=4)分別測定腦組織AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3的表達(dá)情況，采用免疫組織

6、化學(xué)方法測定腦組織中pAKT、pGSK3β表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:1.神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)果:依據(jù)改良神經(jīng)功能損傷程度評分(mNSS)測定各組大鼠神經(jīng)功能改變，與Sham組相比，其余四組神經(jīng)功能缺陷評分明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），與NT組相比MHT組、EPO組及MHT+EPO組神經(jīng)功能缺損評分均有明顯減低（*P＜0.05，**P＜0.01）;與MHT組、EPO組相比MHT+EPO組神經(jīng)功能缺陷評分明顯降低，差異

7、具有統(tǒng)計學(xué)意義(#P＜0.05)。
　　 2.腦組織含水量測定結(jié)果:利用干/濕重法檢測腦組織含水量，Sham組腦組織含水量為77.16±2.11％，NT組為83.23±1.99％;與NT組相比，MHT組、EPO組、MHT+EPO組腦組織含水量降低并具有統(tǒng)計學(xué)差異(NT vs.EPO，83.23±1.99％ vs.80.43±2.38％; NT vs.MHT,83.23±1.99％ vs.79.85±1.78％; NT vs.MH

8、T+EPO,83.23±1.99％ vs.78.12±1.34％)（*P＜0.05，**P＜0.01）;與MHT組、EPO組相比，MHT+EPO組腦組織含水量降低并具有統(tǒng)計學(xué)差異(MHT vs.MHT+EPO,79.85±1.78％ vs.78.12±1.34％; EPO vs.MHT+EPO,80.43±2.38％ vs.78.12±1.34％)(#P＜0.05)。
　　 3.血腦屏障(BBB)通透性測定結(jié)果:Evans藍(lán)測定

9、法檢測BBB通透性，造模成功后，各組BBB通透性均增加（均P＜0.05），與NT組相比，MHT組、EPO組及MHT+EPO組BBB通透性減低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05，**P＜0.01);與MHT組、EPO組相比，MHT+EPO治療組降低BBB通透性的作用更加顯著（#P＜0.05）。
　　 4.HE染色結(jié)果:NT組皮層損傷灶明顯，灶內(nèi)可見大量細(xì)胞核碎片聚集，海馬部位神經(jīng)細(xì)胞有胞體固縮，胞核不清、核拉長或呈三角形等不同程

10、度損傷改變。與NT組相比MHT組、EPO組及MHT+EPO組皮層損傷灶減小，海馬部位神經(jīng)細(xì)胞有胞體固縮/胞核變形情況明顯減少。
　　 5.亞低溫(MHT)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對顱腦創(chuàng)傷大鼠腦組織中AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3表達(dá)的影響:與NT組相比MHT組、EPO組及MHT+EPO組pAkt、pGSK3β、Claudin-5在蛋白水平表達(dá)明顯升高，并差異具

11、有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01），而AKT、GSK3β在各組之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05);MHT組、EPO組及MHT+EPO組Claudin-5轉(zhuǎn)錄水平較NT組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01），且MHT+EPO組Claudin-5轉(zhuǎn)錄水平較MHT組、EPO組明顯增加（#P＜0.05，##P＜0.01）;MHT組、EPO組及MHT+EPO組Caspase-3轉(zhuǎn)錄水平較NT組

12、明顯降低（*P＜0.05，**P＜0.01），且MHT+EPO組Claudin-5轉(zhuǎn)錄水平較MHT組、EPO組減低明顯（#P＜0.05，##P＜0.O1）。
　　 結(jié)論:亞低溫(MHT)及促紅細(xì)胞生成素(EPO)均可降低顱腦創(chuàng)傷大鼠神經(jīng)功能缺陷評分，減輕腦組織水腫，降低血腦屏障(BBB)通透性，上調(diào)了pAkt、pGSK3β、Claudin-5的表達(dá)水平，并降低Caspase-3的表達(dá)水平，對顱腦創(chuàng)傷大鼠腦組織有保護(hù)作用，并且兩種