新型去甲萬古霉素-纖維蛋白膠磷酸鈣人工骨研究.pdf

1、研究背景:近年嚴(yán)重車禍傷、工作及高墜傷等高能量創(chuàng)傷發(fā)生率大大增加。其導(dǎo)致的嚴(yán)重開放性骨折脫位和軟組織損傷發(fā)生率也相應(yīng)增加,因傷者傷口污染與細菌殘留引起的感染是骨科面臨的一大難題,研制一種既能有效的填充骨缺損,又具有局部抗感染能力的生物材料。該生物材料應(yīng)具有良好的生物相容性,可在體內(nèi)自然降解,早期利于骨長入,并且還應(yīng)至少具有松質(zhì)骨以上機械強度等特點,本課題所研究的新型材料可能具備上述兩種功能,是治療感染性骨缺損的理想方法。
　　

2、目的與意義:通過對新型去甲萬古霉素-纖維蛋白膠磷酸鈣人工骨的理學(xué)特點、急性細胞毒性、抗?jié)⑸⒖箾_涮性及其內(nèi)去甲萬古霉素的體外釋放規(guī)律研究,為探索研制既具有局部骨填充作用,又具有抗感染能力的新型生物材料提供相關(guān)實驗依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 1.新型去甲萬古霉素-纖維蛋白膠磷酸鈣人工骨的理學(xué)特性研究
　　 在人工骨固相粉末(β-磷酸三鈣和磷酸二氫鈣按3:1配比)中加入適量去甲萬古霉素(norvancomycin

3、下稱NV)粉末,充分研磨混合,按固液比為1 g:0.4ml加入500 mol/L檸檬酸溶液,充分混均,同時以雙腔推液器將預(yù)先配制好的纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液以相同體積推至上述人工骨膏體中,即制得含NV質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的新型復(fù)合磷酸鈣人工骨(對照組材料僅以β-磷酸三鈣和磷酸二氫鈣混合粉末1g:0.4ml與檸檬酸溶液混均)。分別將適量上述兩種人工骨膏體充分混勻,填入內(nèi)經(jīng)6mm、高12mm的模具中,用水泥稠度凝結(jié)測定儀進行凝結(jié)時間的測試,以單

4、針進入至1/2材料試樣高度為限作為初凝時間,并以進入試樣深度≤0.5mm為終凝時間。另取上述兩組人工骨膏體填入內(nèi)經(jīng)為6mm,高18mm的標(biāo)準(zhǔn)鋼模中,成形后即脫模并置于恒溫恒濕箱中充分水化4周,拋光試樣兩端后以電子式萬能材料試驗機測試其抗壓強度,以上固化時間、固化強度測試每組材料均重復(fù)6次。另取少許樣本做X-線衍射檢測其固化產(chǎn)物及掃描電鏡觀察,同時以排水法測試兩組材料的的孔隙率。測得數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS03.0軟件包處理,并做兩獨立樣本t檢驗

5、其是否有差異。
　　 2.去甲萬古霉素-纖維蛋白膠磷酸鈣人工骨的急性細胞毒性和抗沖涮性能研究
　　 ①急性細胞毒性試驗:取適量按以上實驗方法制得的兩組人工骨材料試件,經(jīng)鈷-60 γ射線照射滅菌后按30g/L投于一定量DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)浸提72h,去除試件并濾除浸提液內(nèi)沉渣部分,按預(yù)定比例往浸提液內(nèi)加入一定量胎牛血清,分別配成含10％胎牛血清的全培養(yǎng)液備用。另以普通正常DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基配成10％胎牛血清

6、的全培養(yǎng)液進行對比,每組設(shè)三個重復(fù)組。
　　 經(jīng)頸椎脫臼法處死SD大鼠后在無菌條件下取其雙側(cè)股、脛骨骨髓液,并分別以上述制成的三組全細胞培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,以全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)貼壁細胞(主要為骨髓間充質(zhì)干細胞),光學(xué)顯微鏡下觀察待細胞融合至約85％-90％時以細胞計數(shù)板計數(shù)各組培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞數(shù)量級,并觀察各時期細胞的形態(tài)變化,以此作為材料對細胞的急性毒性的初步評價指標(biāo)。
　　 ②材料的抗?jié)⑸⑿约翱箾_涮性研究:用傳統(tǒng)的浸泡法及模

7、擬術(shù)中松質(zhì)骨持續(xù)滲血兩種方法測試材料的抗?jié)⑸⑿约翱箾_涮性,后者作為一種改良測試材料的抗沖涮性方法,是骨水泥漿體注射后給予一定的動態(tài)沖涮力,并以達到終凝后剩余質(zhì)量(m1)與初始質(zhì)量(m2)的比值作為衡量其抗沖涮性能的指標(biāo),每組材料重復(fù)3次取均值。同時觀察材料的表面形態(tài)和粗糙程度。
　　 3.去甲萬古霉素-纖維蛋白膠磷酸鈣人工骨中抗菌素的體外釋放特點研究
　　 將標(biāo)準(zhǔn)NV溶液配成200mg/L,100mg/L,50mg/L,

8、25mg/L,12.5mg/L,6.25mg/L濃度梯度,以紫外分光光度計在室內(nèi)溫度條件下對200-800nm波長范圍進行掃描,以出現(xiàn)最高峰值波長為檢測波長進行實驗,測量各濃度梯度去甲萬古霉素溶液的OD值,結(jié)果經(jīng)SPSS13.0軟件包處理算得其標(biāo)準(zhǔn)回歸方程并對其進行檢驗。取適量兩組材料試件投于0.9％生理鹽水中持續(xù)浸提,前10d每24h、之后每5d/次以潔凈注射器抽取全部浸提液送OD值檢測,將材料試件取出并置于另一潔凈試管中,重新注入等

9、量生理鹽水繼續(xù)浸提,依次類推直至浸提液內(nèi)抗菌素濃度接近零,實驗結(jié)束。
　　 根據(jù)上述得出的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程,計算出兩組材料試件中抗菌素釋放量與時間的關(guān)系。測量隨時間(d)變化,兩組材料浸提液OD值、去甲萬古霉素藥液濃度x(mg/L)及抗菌素累計釋放量占總藥量百分比P(％)變化情況,用SPSS13.0軟件包作浸提天數(shù)(d)對每日浸提液OD值的分群金字塔圖。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.新型復(fù)合材料的理學(xué)特點:
　

10、　 新型NV-FG-CPC材料的初凝、終凝時間均較單純CPC組明顯短縮,分別縮短1.08min和3.28min。隨著FG及NV的摻入,新型人工骨的抗壓強度明顯下降,水化4周后,NV-FG-CPC組與單純CPC組材料的抗壓強度分別為6.43±1.09Mpa和14.72±3.38Mpa(統(tǒng)計檢驗t=5.710,P<0.01,)。前者的孔隙率較后者提高4個百分點,新型材料的主要固化產(chǎn)物仍為磷酸鈣,掃描電鏡觀察可見FG將CPC晶體連接成片,且

11、可見散在分布的,與背景顆粒不甚一致,大小約為3-6μm的抗菌素顆粒。
　　 2.材料的急性細胞毒性,抗?jié)⑸⒓翱箾_涮性結(jié)果:
　　 各組培養(yǎng)瓶內(nèi)原代細胞生長良好,培養(yǎng)約第14d三瓶細胞達到85％-90％融合率,此時各組培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞形態(tài)較一致,狀態(tài)良好,大部分呈長梭形或短梭形,且三組細胞數(shù)目數(shù)量級均達106/L。單純CPC組于生理鹽水溶液內(nèi)24h后即可見周圍被云霧狀帶包繞,而NV-FG-CPC組周圍未見此現(xiàn)象發(fā)生,僅見少量脫

12、落的水泥小粒。3次重復(fù)實驗NV-FG-CPC組見玻管內(nèi)仍剩余大量骨水泥塊,初始質(zhì)量及達到終凝后質(zhì)量均值分別為0.903g及0.750g,殘余ml/m2=83.1％,沖涮面骨水泥表面較光滑,周圍未見明顯水泥小粒。而CPC組玻管內(nèi)剩余的骨水泥量明顯減少,沖涮面骨水泥粗糙不平,且見容器內(nèi)大量被沖散的骨水泥小粒,以同樣方法算得其m2=0.840g,m1=0.567g,m1/m2=67.5％。利用改良抗沖涮實驗測得新型材料在動態(tài)狀狀下具有較更強的

13、抗沖涮能力,結(jié)果與傳統(tǒng)方法測得其抗?jié)⑸⑿砸恢隆?br>　　 3.新型材料中去甲萬古霉素的體外釋放規(guī)律:
　　 標(biāo)準(zhǔn)NV溶液在室內(nèi)25℃條件下于226nm波長處出現(xiàn)最大吸收峰,生理鹽水中OD值隨溶液濃度x(mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為:OD=0.013x+0.173(R2=0.971,調(diào)整R2=0.964,方程檢驗F=133.58,P=0.00,說明該方程有統(tǒng)計學(xué)意義,NV溶液OD值隨其濃度變化趨勢可以上述方程表示)。
　　

14、 新型材料中去甲萬霉素跟傳統(tǒng)載藥體系類似,先產(chǎn)生一次暴發(fā)性釋放過程,此過程持續(xù)時間分別為4d和6d。之后NV-FG-CPC系統(tǒng)間隔2d后再次出現(xiàn)一次持續(xù)釋放抗菌素的高峰期,時間約達8d,而CPC體系內(nèi)藥液濃度呈持續(xù)下降趨勢。新型材料組中去甲萬古霉素可維持釋放時間至少達6周以上,而對照組大約在第4周時藥液濃度急劇降至最低抗菌濃度以下,兩組材料內(nèi)去甲萬古霉素總釋放量分別在第30d、第15d達到總含量的90％以上。
　　 主要結(jié)論:

15、
　　 1.新研制的去甲萬霉素-纖維蛋白膠磷酸鈣人工骨具有良好的理學(xué)特性,其自固化時間及固化后的抗壓強度均達人工骨的臨床應(yīng)用要求,具有較強的可操作性。新型材料固化后的主要產(chǎn)物仍為磷酸鈣,且隨著纖維蛋白膠的加入孔隙率有所提高,新型復(fù)合材料在電鏡下可見抗菌素顆粒,表明去甲萬古霉素顆粒成功復(fù)合到材料中。
　　 2.在傳統(tǒng)型磷酸鈣人工骨中同時復(fù)合去甲萬古霉素、纖維蛋白膠后并未產(chǎn)生新的有毒物質(zhì),材料的急性細胞毒性實驗顯示其生物安全