LADA與CTLA-4、VDR、MIC-A基因多態(tài)性的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:探討細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4基因外顯子1的49位點、維生素D受體基因BsmⅠ酶切位點、MHC相關(guān)基因A外顯子5多態(tài)性與深圳市成人遲發(fā)性自身免疫性糖尿病的關(guān)系。
　　 方法:
　　 糖尿病診斷和分型標準按1997年ADA標準。在深圳市第二人民醫(yī)院門診、綜合科病房、內(nèi)分泌科病房隨機選取LADA患者及2型糖尿病，分為LADA組及2型糖尿病組，并隨機從深圳市第二人民醫(yī)院體檢中心選取健康體檢人員作為對照組。按標準確定LA

2、DA患者、2型糖尿病和對照人員?？崭寡?、餐后2h血糖、空腹胰島素、CP及餐后2h胰島素、CP水平測定分別由深圳市第二人民醫(yī)院檢驗科和放免室完成用購自加拿大Beyondbio公司試劑盒測定LADA患者、2型糖尿病和對照人員GADAb、ICA?；蚪MDNA制備用購至美國OMEGA公司的試劑盒提取。查找Gene bank后設計引物序列，應用PCR方法擴增CTLA-4、VDR、MIC-A目的基因，然后用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈

3、下觀察PCR擴增結(jié)果并拍照。用BbvI 內(nèi)切酶、Bsm I內(nèi)切酶特異地結(jié)合于CTLA-4、VDR目的基因的DNA序列之內(nèi)，并切割雙鏈DNA，然后用2％瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色，紫外燈下觀察酶切結(jié)果并拍照。MIC-A外顯子5基因PCR產(chǎn)物加變性上樣緩沖液，95℃變性，8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.2％硝酸銀染色，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。
　　 結(jié)果:
　　 成功的從血液中提取基因組DNA，擴增CTLA-4、VDR、M

4、IC-A目的基因及用BbvI 內(nèi)切酶、Bsm I內(nèi)切酶特異地酶切CTLA-4、VDR目的基因。MIC-A變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色。LADA患者CTLA-4基因外顯子1G49等位基因頻率顯著高于正常對照組（P＜0.01）和T2DM組（P＜0.01），主要表現(xiàn)為基因型GG顯著高于正常對照組（P=1.3×10-2)和T2DM組（P=3.4×10-2)，基因型AG也明顯高于正常對照組（P＜0.01)和T2DM組（P=3.3×10-2)

5、,基因型AA顯著降低正常對照組（P＜0.01）和T2DM組（P＜0.01）。T2DM患者VDR基因B等位基因頻率明顯高于正常對照組（P=2.7×10-2），基因型Bb明顯高于正常對照組（P=1.6×10-2),基因型bb明顯低于正常對照組（P=1.6×10-2）；LADA患者Bb基因型頻率以及B等位基因頻率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。LADA患者A5.1等位基因頻率顯著高于正常對照組（P<0.05）；2型糖尿病MICA