STAT3活化對B細胞淋巴瘤與巨噬細胞間相互作用影響的體外實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 浸潤到腫瘤組織中的巨噬細胞被稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associatedmacrophages，TAMs)，因其在腫瘤微環(huán)境中的重要作用而受到廣泛關注。最近研究顯示，TAMs特別是M2型巨噬細胞參與到多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，這其中包括血液學的惡性腫瘤，如霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、免疫母T細胞淋巴瘤等，在這些腫瘤中CD163抗體標識陽性的M2型巨噬細胞高表達預示著預后不良。
　　

2、 信號傳導與轉錄激活因子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription3，Stat3)是一種與腫瘤的血管生成、免疫抑制、細胞生長、細胞增殖等密切相關的信號因子，在多種惡性腫瘤中，腫瘤細胞Stat3的活化與患者的低生存率密切相關。我們在先前的研究中也已經證明，中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤、腎細胞瘤、卵巢癌以及神經膠質瘤細胞與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)時，Stat3信號傳導通路會明顯活化，但是細胞間相互作用

3、的分子機制并沒有得到詳細闡述。
　　 BrdU是一種DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，能夠競爭性摻入DNA合成期細胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。由于組織細胞內無內源性BrdU存在，故可通過測定細胞中BrdU摻入水平來間接反映細胞增殖的狀況。
　　 目的:
　　 探討在體外共培養(yǎng)試驗中，Stat3活化對B細胞淋巴瘤細胞與巨噬細胞間相互作用的意義。
　　 方法:
　　 1.體外共培養(yǎng)對淋巴瘤細胞增殖

4、的影響
　　 外周血由來的單核細胞來自于2名健康志愿者，免疫磁珠法收集CD14陽性單核細胞。GM-CSF加入單核細胞培養(yǎng)基中刺激5天誘導其分化成未成熟的巨噬細胞，再加入IFN-γ刺激24h誘導未成熟的巨噬細胞分化成成熟的M1型巨噬細胞;GM-CSF和M-CSF共同加入單核細胞培養(yǎng)基中刺激5天誘導其分化成未成熟的M2型巨噬細胞，再加入IL-10刺激24h誘導未成熟的M2型巨噬細胞分化成成熟的M2型巨噬細胞。淋巴瘤細胞系與巨噬細胞在

5、含有2％FBS/D-MEM的24孔培養(yǎng)皿中直接共培養(yǎng)，間接共培養(yǎng)是用一個多聚碳酸膜將巨噬細胞與淋巴瘤細胞分開，共培養(yǎng)3天后，BrdU摻入并行雙重免疫染色評價腫瘤細胞的增殖狀況。簡略說明雙重免疫染色的過程:加入BrdU孵育3h后，細胞涂片離心機將細胞收集到載玻片上并用丙酮固定，CD204作為全部巨噬細胞的標識物進行免疫染色并行DAB顯色，甘氨酸緩沖液(PH2.2)沖洗殘余抗體，抗BrdU抗體染色并用HistiGreen溶液顯色。
　

6、　 2.Stat3活化對淋巴瘤細胞增殖的影響
　　 siRNA干擾沉默淋巴瘤細胞Stat3，Westernblot檢測SLVL細胞中Stat3蛋白的表達水平。共培養(yǎng)3天后，BrdU摻入并行雙重免疫染色評價腫瘤細胞的增殖狀況。
　　 3.C5a對淋巴瘤細胞與巨噬細胞間相互作用的影響
　　 應用細胞因子分析分別檢測單培養(yǎng)和共培養(yǎng)時培養(yǎng)液中存在的的可溶性細胞因子，RT-PCR檢測C5a受體的表達。SLVL細胞在C5a

7、刺激下培養(yǎng)24h，然后BrdU摻入并行免疫染色評價其對腫瘤細胞增殖的影響，行Westernblot檢測SLVL細胞中pStat3蛋白的表達水平。SLVL細胞與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中加入C5a受體阻斷劑，共同孵育24h，BrdU摻入并行免疫染色評價腫瘤細胞的增殖狀況。
　　 結果:
　　 1.與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)后，淋巴瘤細胞增殖活性顯著增強
　　 B細胞淋巴瘤系SLVL細胞分別與imM(未成熟的)、M1

8、及M2型巨噬細胞共培養(yǎng)三天，BrdU摻入后行雙重免疫染色評價淋巴瘤細胞的細胞增殖情況，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與M2型巨噬細胞直接共培養(yǎng)的SLVL細胞中，更多摻入了BrdU。測量SLVL細胞核的最大直徑發(fā)現(xiàn)，單培養(yǎng)的SLVL細胞為15.7±2.8μm，與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)的SLVL細胞為18.8±2.7μm(P=0.003，n=20)。相比單培養(yǎng)以及imM、M1型巨噬細胞共培養(yǎng)，與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)的的SLVL細胞中更多的摻入了BrdU;在另

9、外兩種B細胞淋巴瘤細胞（Raji，Daudi）的共培養(yǎng)實驗中，也得到了相似的結果。另外，我們嘗試用一個跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)將巨噬細胞與SLVL細胞分開進行間接共培養(yǎng)，相比之下，直接共培養(yǎng)的SLVL細胞中BrdU摻入更加明顯。
　　 2.巨噬細胞誘導淋巴瘤細胞增殖依賴于Stat3的活化
　　 為了檢測Stat3活化在淋巴瘤細胞與巨噬細胞間相互作用中的意義，共培養(yǎng)實驗前用siRNA沉默SLVL細胞Stat3基因，結果顯示，Stat3

10、蛋白的下調明顯抑制了SLVL細胞中BrdU的摻入。
　　 3.C5a參與了M2型巨噬細胞與淋巴瘤細胞間的相互作用
　　 對M1、M2、SLVL以及共培養(yǎng)的培養(yǎng)液進行細胞因子分析，結果在M2的上清中發(fā)現(xiàn)了大量C5a。巧合的是SLVL細胞表達C5a的受體，在SLVL細胞中加入C5a進行培養(yǎng)，行Westernblot測定其pStat3的表達，結果顯示pStat3蛋白表達明顯增強;經C5a刺激后更多的SLVL細胞中摻入了BrdU

11、;而已經用siRNA沉默Stat3基因的SLVL細胞經C5a刺激后，其BrdU摻入并無明顯變化。最后，在SLVL與M2型巨噬細胞細胞的共培養(yǎng)液中加入C5a受體拮抗劑，發(fā)現(xiàn)摻入BrdU的SLVL細胞數(shù)略微減少，但是這種變化并不十分明顯。
　　 結論:
　　 1.B細胞淋巴瘤細胞與M2型巨噬細胞相互作用導致Stat3活化是腫瘤進展過程中非常重要的步驟，能夠使M2型巨噬細胞失活的Stat3抑制劑或者化合物可能會成為一種對B細胞