針刺大鼠內(nèi)關(guān)穴對鹽酸多巴酚丁胺正性肌力作用的增效機制研究.pdf

1、研究背景
　　 以靶向性和效應(yīng)都非常明確的藥物,即心肌細(xì)胞β1-腎上腺素能受體(β1-adrenergic receptor,β1-AR)激動劑一鹽酸多巴酚丁胺(DobutamineHydrochloride,DH)為探針,觀察針刺大鼠內(nèi)關(guān)穴對DH的增效作用,并在此基礎(chǔ)上通過對血藥濃度和靶器官藥物濃度的比較分析,以及對穴位針刺后靶器官受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上一系列信號成分及其對選擇性藥物反應(yīng)性的檢測,分析靶器官受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上哪個

2、或哪些信號成分參與介導(dǎo)了針刺對DH的增效作用,從而系統(tǒng)闡明穴位針刺對藥物增效作用的受體后機制。
　　 方法：
　　 一、針?biāo)幗Y(jié)合增效作用的觀察確定
　　 實驗用清潔級健康雄性SD大鼠120只,隨機分為正常對照(NC)組、常規(guī)靜脈注射(intravenous injection,Ⅳ)組、常規(guī)肌肉注射(intramuscular injection,IM)組和電針內(nèi)關(guān)穴+穴位注射(EA-IN)組,各組動物在記錄10

3、min正常對照數(shù)據(jù)后,再分別以不同的方式進(jìn)行給藥。Ⅳ組注射部位為右側(cè)股靜脈；IM組注射部位為右后肢臀部肌肉豐厚處；EA-IN組在電針雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴10 min后,穴位注射DH。分別觀察比較同劑量的DH在上述不同途徑給藥及干預(yù)下左心室內(nèi)壓(LVSP)、左室壓力上升最大變化速率(+dp/dtmax)、心率(HR)的變化,以確定穴位針刺對DH的增效作用。
　　 二、不同途徑給藥后血藥濃度的比較研究
　　 采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC

4、-MS/MS)觀察比較在上述不同途徑給予相同劑量DH后2、5、15 min三個時間點的血藥濃度的差異,以判斷血藥濃度的改變是否是穴位針刺特異性增效作用的機制之一。
　　 三、不同途徑給藥后靶器官藥物濃度的比較研究
　　 采用LC—MS/MS觀察比較在上述不同途徑給予相同劑量DH后2、5、15 min三個時間點時在靶器官-心肌組織中的該藥物濃度差異,以判斷增加藥物靶器官濃度是否是穴位針刺特異性增效作用的機制之一。
　

5、　 四、心肌細(xì)胞β1-AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在針?biāo)幗Y(jié)合增效中的作用分析
　　 在第一部分工作證明EA-IN組增強心臟功能的效應(yīng)優(yōu)于常規(guī)肌肉注射的基礎(chǔ)上,設(shè)正常對照(NC)組、電針內(nèi)關(guān)(EA)組,觀察比較心肌細(xì)胞β1-AR的數(shù)量及其反應(yīng)性、Gs-蛋白含量、腺苷酸環(huán)化酶(AC)的反應(yīng)性、cAMP含量、蛋白激酶A(PKA)的反應(yīng)性、L-型Ca2+通道的反應(yīng)性,來分析靶器官受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上哪個或哪些信號成分參與介導(dǎo)了不同穴位針刺引起的特異

6、性藥物的增效作用。具體實驗方法如下:
　　 a.采用免疫印跡法(Western Blotting)觀察比較心肌細(xì)胞β1-AR的含量,并以熒光染料Fura-2為鈣標(biāo)記,測量單個心肌細(xì)胞內(nèi)鈣對β1-AR激動劑DH的反應(yīng)性,以探討穴位針刺是否通過改變其特異性靶器官-心臟β1-AR的數(shù)量或反應(yīng)性,進(jìn)而達(dá)到對DH的特異性增效作用；
　　 b.采用Western Blotting方法測定心肌細(xì)胞Gs-蛋白含量,以探討不同穴位針刺是否

7、通過改變β1-AR后信號成分-Gs-蛋白,進(jìn)而達(dá)到對DH的特異性增效作用；
　　 c.以熒光染料Fura-2為鈣標(biāo)記,測量單個心肌細(xì)胞內(nèi)鈣對AC激動劑Forskolin的反應(yīng)性,以探討不同穴位針刺是否通過改變β1-AR后信號成分-AC,進(jìn)而達(dá)到對DH的增效作用；
　　 d.采用ELISA法測定心肌cAMP含量,以探討不同穴位針刺是否通過改變β1-AR后信號成分-cAMP,進(jìn)而達(dá)到對DH的增效作用；
　　 e.以熒

8、光染料Fura-2為鈣標(biāo)記,測量單個心肌細(xì)胞內(nèi)鈣對PKA激動劑DB—cAMP的反應(yīng)性,以探討不同穴位針刺是否通過改變β1-AR后信號成分-PKA,進(jìn)而達(dá)到對DH的增效作用；
　　 f.以熒光染料Fura-2為鈣標(biāo)記,測量單個心肌細(xì)胞內(nèi)鈣對鈣通道激動劑-Bay—K8644的反應(yīng)性,以探討不同穴位針刺是否通過改變β1-AR后信號成分-鈣通道,進(jìn)而達(dá)到對DH的增效作用。
　　 結(jié)果：
　　 一、藥理效應(yīng)
　　

9、以LVSP、+dp/dtmax、HR為檢測指標(biāo),經(jīng)不同途徑給予DH后觀察到:2min時EA-IN組和IV組藥理作用相當(dāng)(P>0.05),但EA-IN組比Ⅳ組維持時間長(P<0.01),尤其5 min時EA-IN組的作用明顯強于其他各組,給藥15 min時EA-IN組的作用強度與IM組相當(dāng)(P>0.05),且強于Ⅳ組(P<0.01)。
　　 二、血藥濃度
　　 注射DH后2 min時,Ⅳ組血藥濃度增加最為明顯,EA-IN組

10、血藥濃度雖低于Ⅳ組(P<0.01),但明顯高于IM組(P<0.01)。在注射后5 min時,Ⅳ組血藥濃度下降至2 min時的一半,而EA-IN組血藥濃度與2min時血藥濃度相仿,且高于同時間點IM組的血藥濃度(P<0.01)。在注射后15 min時,Ⅳ組血中DH基本上代謝完畢,而EA-IN組血藥濃度仍維持在較高水平,且明顯高于同時間點IM組血藥濃度的水平(P<0.05)。
　　 三、靶器官-心肌組織藥物濃度
　　 注射D

11、H后2 min時,各組動物心肌組織中的藥物濃度均有不同程度的增加,其中以Ⅳ組和EA-IN組增加最為明顯,且明顯高于IM組(P均<0.01)。在注射后5 min時,Ⅳ組心肌組織中的藥物濃度迅速下降,而EA—IN組心肌組織中的藥物濃度與2 min時相比繼續(xù)升高,并高于Ⅳ組和IM組(P<0.01,P<0.05)。在注射后15 min時,EA-IN組和IM組的心肌組織中的藥物濃度基本仍維持在同一較高水平(P>0.05),IM組高于Ⅳ組相應(yīng)時間點

12、心肌組織中的藥物濃度(P<0.05)。
　　 四、β1-AR后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析
　　 電針內(nèi)關(guān)穴后,其心肌細(xì)胞膜上β1-AR蛋白水平有增高趨勢,且EA組大鼠分離的單個心肌細(xì)胞在DH作用下鈣瞬變的波幅與NC組單個心肌細(xì)胞在DH作用下鈣瞬變的波幅比較亦有增加的趨勢,但兩組β1-AR相關(guān)指標(biāo)的差別無統(tǒng)計學(xué)意義；
　　 電針后心肌細(xì)胞膜上Gsα蛋白水平與NC組心肌細(xì)胞膜Gsα蛋白水平相比有增高趨勢,但兩組差別無統(tǒng)計學(xué)意義

13、；
　　 EA組大鼠分離的單個心肌細(xì)胞在Forskolin作用下鈣瞬變的波幅與NC組單個心肌細(xì)胞在Forskolin作用下鈣瞬變的波幅比較增加的幅度明顯升高(P<0.05),提示電針內(nèi)關(guān)穴增強了心肌細(xì)胞對AC激動劑Forskolin的反應(yīng)性；
　　 EA組大鼠心肌組織cAMP含量與NC組大鼠心肌組織cAMP含量比較有增加的趨勢,但兩組差別無統(tǒng)計學(xué)意義；
　　 EA組大鼠分離的單個心肌細(xì)胞在DB-cAMP作用下鈣瞬

14、變的波幅與NC組單個心肌細(xì)胞在DB-cAMP作用下鈣瞬變的波幅比較有增加的趨勢,但兩組差別無統(tǒng)計學(xué)意義；
　　 EA組大鼠分離的單個心肌細(xì)胞在Bay K-8644作用下鈣瞬變的波幅與NC組單個心肌細(xì)胞在Bay K-8644作用下鈣瞬變的波幅比較亦有增加的趨勢,但兩組差別無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 上述結(jié)果表明,針刺內(nèi)關(guān)對DH確有增效作用,其機制可能涉及以下三個方面:①針刺穴位能夠通過影響DH的血藥濃度,從