重慶市水環(huán)境中抗生素污染與微生物抗生素耐藥性研究.pdf

1、隨著人畜藥物使用量的劇增和環(huán)境分析測(cè)試技術(shù)的快速發(fā)展，水環(huán)境中藥物污染研究近年在德國(guó)、丹麥、瑞士和美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家受到了前所未有的關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明：多數(shù)藥物在人和動(dòng)物機(jī)體內(nèi)都不能夠被完全代謝，多以原形和活性代謝產(chǎn)物的形式通過(guò)糞便排到體外。這些物質(zhì)最終會(huì)通過(guò)醫(yī)院污水、城市生活污水、牲畜糞便及醫(yī)藥工業(yè)廢水等多種途徑進(jìn)入水環(huán)境造成污染。在水環(huán)境的藥物污染中，抗生素污染是顯得格外重要的一類(lèi)。醫(yī)藥行業(yè)為牟取暴利而不合理使用抗生素、畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)為

2、增產(chǎn)而大量使用抗生素的現(xiàn)象使得抗生素對(duì)生態(tài)環(huán)境的負(fù)面作用正逐漸顯現(xiàn)。德國(guó)、瑞士、丹麥和美國(guó)等國(guó)先后有人報(bào)道在醫(yī)院污水、污水處理廠(chǎng)污水和活性污泥、水產(chǎn)養(yǎng)殖廠(chǎng)水體和底泥、地表水和地下水等水體中檢出多類(lèi)不同濃度的抗生素。水環(huán)境抗生素污染最有可能產(chǎn)生的效應(yīng)是其持續(xù)低水平的暴露對(duì)水生生物的遠(yuǎn)期毒性作用和對(duì)其微生物群落產(chǎn)生的抗生素耐藥性選擇壓力，后者與人類(lèi)健康的關(guān)系更為密切。水環(huán)境微生物耐藥性衛(wèi)生學(xué)意義重大：耐藥微生物及耐藥因子可經(jīng)多途徑侵入機(jī)體，

3、將耐藥性傳遞給體內(nèi)致病菌，加大感染性疾病的治療難度；抗生素耐藥譜分析(antibioticresistantanalysis，ARA)是近年發(fā)展并得到應(yīng)用的水污染的微生物源追蹤(microbialsourcetracking，MST)技術(shù)的主要研究方法之一。 本課題第一部分以地處三峽庫(kù)區(qū)的重慶市水環(huán)境為研究對(duì)象，對(duì)水環(huán)境中的抗生素污染進(jìn)行初步探索，為今后的深入研究和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供基礎(chǔ)。第二部分以耐熱性大腸菌群(亦稱(chēng)為糞大腸菌群)為

4、指示菌，對(duì)重慶市多種水體中微生物對(duì)十種常用抗生素的耐藥性進(jìn)行了初步調(diào)查研究，并為在重慶市以ARA為手段進(jìn)行MST研究提供了線(xiàn)索。第三部分對(duì)所有分離的耐熱性大腸菌群的質(zhì)粒譜進(jìn)行分析，對(duì)菌株的多重耐藥性決定因子進(jìn)行初步定位。 實(shí)驗(yàn)方法：采集水樣：采集唐家橋污水處理廠(chǎng)進(jìn)水、一級(jí)處理污水和二級(jí)處理污水，西南醫(yī)院、324醫(yī)院、腫瘤醫(yī)院和新橋醫(yī)院污水處理站出水，沙坪壩水廠(chǎng)、渝中區(qū)水廠(chǎng)、江南水廠(chǎng)、和尚山水廠(chǎng)和西南制藥廠(chǎng)水廠(chǎng)水源水，屠宰場(chǎng)下游地

5、表水和畜禽養(yǎng)殖廠(chǎng)下游地表水水樣。確定受試抗生素為：氧四環(huán)素(Oxytetracycline)、四環(huán)素(Tetracycline)和氯四環(huán)素(Chlortetracycline)。固相萃取(SPE，solidphaseextraction)：經(jīng)預(yù)處理的SAX(500mg/6ml)和HLB(500mg/6ml)固相萃取小柱串聯(lián)過(guò)水樣，后者用檸檬酸緩沖液和沖洗后在氮?dú)饬飨麓蹈?，甲醇洗脫。洗脫液?jīng)氮?dú)獯蹈珊笥?00μl流動(dòng)相A定容，-20℃儲(chǔ)存

6、備測(cè)。用HPLC/MS對(duì)各水樣中經(jīng)SPE所得富集產(chǎn)物中的四環(huán)素進(jìn)行分析測(cè)試。色譜柱為PhenonomenexLunaC18(150×3.0mm,3μm)。以流動(dòng)相A(含10mM甲酸銨、0.3％甲酸和10％甲醇的水溶液)和流動(dòng)相B(含10mM甲酸銨、1.0％甲酸的甲醇溶液)進(jìn)行梯度洗脫，分離受試化合物。離子化采用電噴霧陽(yáng)離子模式(ESI(+))，監(jiān)測(cè)方法為選擇性離子監(jiān)測(cè)(SIM)。四環(huán)素的鑒定以保留時(shí)間、定量離子與確認(rèn)離子(1或2種)的比

7、值為依據(jù)，其定量通過(guò)分析物與內(nèi)標(biāo)物(Simatone)的基峰離子面積比值來(lái)計(jì)算。 以耐熱性大腸菌群作為指示菌分析重慶市水環(huán)境中微生物對(duì)人畜常用十種抗生素的耐藥性并小量制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行質(zhì)粒譜分析。采集的水樣有：受醫(yī)院污水污染地表水樣，屠宰場(chǎng)下游與畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)下游地表水樣，污水處理廠(chǎng)進(jìn)水與出水、嘉陵江地表水，歌樂(lè)山山頂泉水。富集分離并鑒定菌株：用經(jīng)美國(guó)國(guó)家環(huán)保局認(rèn)證的濾膜法對(duì)各水樣中耐熱性大腸菌群進(jìn)行富集分離，并用APILabPlu

8、s微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。抗生素敏感性試驗(yàn)：采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS1997版)推薦的Kirby-Bauer瓊脂擴(kuò)散法，選擇人畜最常用的青霉素、氨芐青霉素、頭孢他啶、慶大霉素、丁胺卡那霉素、紅霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星等10種抗生素進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。分析菌株質(zhì)粒譜：用堿裂解法小量制備各分離菌株的質(zhì)粒DNA，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳后用Quantityone系統(tǒng)估算其大小，分析菌株質(zhì)粒譜。 實(shí)

9、驗(yàn)結(jié)果：1.從重慶市5種水體的14個(gè)水樣中檢出濃度為0.015～0.214μg/L的氯四環(huán)素、氧四環(huán)素和四環(huán)素。其中有8個(gè)水樣至少檢測(cè)到1種四環(huán)素，檢出最多的是測(cè)到3種四環(huán)素的污水處理廠(chǎng)進(jìn)水。 2.從7種不同水體分離得到的162株耐熱大腸桿菌中156株(96.3％)為埃希氏大腸桿菌，5株為克雷伯氏菌，1株為亞利桑那沙門(mén)氏菌，埃希氏大腸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。除3株分離自山泉水的菌僅對(duì)青霉素和紅霉素兩種抗生素耐藥外，其它菌株都對(duì)3種及3種以

10、上抗生素耐藥，多重耐藥率達(dá)到98.1％，對(duì)所選十種抗生素都耐受的菌為15株(9.3％)。十種抗生素耐藥率依次為：青霉素100％，紅霉素99.4％，鏈霉素85.2％，氧氟沙星74.5％，環(huán)丙沙星56.8％，諾氟沙星56.2％，慶大霉素47.5％，頭孢他啶42.0％，氨芐青霉素33.3％，丁胺卡那霉素22.2％。不同水體分離菌株對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素、鏈霉素等5種抗生素的耐藥率有顯著性的差異(P＜0.005)。不同水體

11、的分離株耐藥率兩兩比較發(fā)現(xiàn)：除嘉陵江地表水和屠宰場(chǎng)、畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)下游地表水外，其它不同水體間微生物對(duì)1～5種抗生素的耐藥率具有顯著性差異(P＜0.01250)。污水處理廠(chǎng)進(jìn)水和出水分離菌株的抗生素耐藥率無(wú)顯著性差異(P＞0.01250)。 3.162株分離菌株中有92株(56.8％)提取到大小為0.90～158.83Kb、數(shù)量為1～6個(gè)的質(zhì)粒，有81種質(zhì)粒譜型。70株(43.2％)未提取到質(zhì)粒的細(xì)菌中對(duì)2種抗生素耐受的有3株，其余

12、67株均對(duì)3種及3種以上抗生素耐受(多重耐藥)；具有相同質(zhì)粒譜型的菌株耐藥譜都不相同；未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒數(shù)量的多少與抗生素耐受種類(lèi)多少間有明顯相關(guān)性。 結(jié)論與展望：1.SPE與HPLC/MS適于對(duì)重慶市水環(huán)境中抗生素污染進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。2.重慶市多種水體中普遍存在痕量水平的四環(huán)素類(lèi)抗生素，應(yīng)進(jìn)行周密布點(diǎn)，選擇出具代表性的抗生素，對(duì)重慶市水環(huán)境中抗生素污染進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。3.重慶市水環(huán)境中微生物的抗生素耐藥性已普遍存在，形成原因有待深入研究。

13、4.不同水體分離的耐熱性大腸菌群對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素和鏈霉素的耐藥性有顯著性差異，可以這五種抗生素為代表進(jìn)一步研究重慶地區(qū)耐熱大腸菌群各宿主(如人、各種家禽家畜)糞便及各種水體中耐熱性大腸菌群的抗生素耐藥性并建立相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，為以ARA進(jìn)行微生物污染源追蹤的可行性研究奠定基礎(chǔ)。5.在重慶市醫(yī)院污水、污水處理廠(chǎng)出水和嘉陵江地表水的水質(zhì)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中加入微生物耐藥性指標(biāo)具有重要意義。6.未發(fā)現(xiàn)耐熱性大腸菌群質(zhì)粒譜與耐藥譜間