重慶市水環(huán)境中抗生素污染與微生物抗生素耐藥性研究.pdf

1、隨著人畜藥物使用量的劇增和環(huán)境分析測試技術(shù)的快速發(fā)展，水環(huán)境中藥物污染研究近年在德國、丹麥、瑞士和美國等發(fā)達國家受到了前所未有的關(guān)注。現(xiàn)有研究表明：多數(shù)藥物在人和動物機體內(nèi)都不能夠被完全代謝，多以原形和活性代謝產(chǎn)物的形式通過糞便排到體外。這些物質(zhì)最終會通過醫(yī)院污水、城市生活污水、牲畜糞便及醫(yī)藥工業(yè)廢水等多種途徑進入水環(huán)境造成污染。在水環(huán)境的藥物污染中，抗生素污染是顯得格外重要的一類。醫(yī)藥行業(yè)為牟取暴利而不合理使用抗生素、畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)為

2、增產(chǎn)而大量使用抗生素的現(xiàn)象使得抗生素對生態(tài)環(huán)境的負(fù)面作用正逐漸顯現(xiàn)。德國、瑞士、丹麥和美國等國先后有人報道在醫(yī)院污水、污水處理廠污水和活性污泥、水產(chǎn)養(yǎng)殖廠水體和底泥、地表水和地下水等水體中檢出多類不同濃度的抗生素。水環(huán)境抗生素污染最有可能產(chǎn)生的效應(yīng)是其持續(xù)低水平的暴露對水生生物的遠(yuǎn)期毒性作用和對其微生物群落產(chǎn)生的抗生素耐藥性選擇壓力，后者與人類健康的關(guān)系更為密切。水環(huán)境微生物耐藥性衛(wèi)生學(xué)意義重大：耐藥微生物及耐藥因子可經(jīng)多途徑侵入機體，

3、將耐藥性傳遞給體內(nèi)致病菌，加大感染性疾病的治療難度；抗生素耐藥譜分析(antibioticresistantanalysis，ARA)是近年發(fā)展并得到應(yīng)用的水污染的微生物源追蹤(microbialsourcetracking，MST)技術(shù)的主要研究方法之一。 本課題第一部分以地處三峽庫區(qū)的重慶市水環(huán)境為研究對象，對水環(huán)境中的抗生素污染進行初步探索，為今后的深入研究和動態(tài)監(jiān)測提供基礎(chǔ)。第二部分以耐熱性大腸菌群(亦稱為糞大腸菌群)為

4、指示菌，對重慶市多種水體中微生物對十種常用抗生素的耐藥性進行了初步調(diào)查研究，并為在重慶市以ARA為手段進行MST研究提供了線索。第三部分對所有分離的耐熱性大腸菌群的質(zhì)粒譜進行分析，對菌株的多重耐藥性決定因子進行初步定位。 實驗方法：采集水樣：采集唐家橋污水處理廠進水、一級處理污水和二級處理污水，西南醫(yī)院、324醫(yī)院、腫瘤醫(yī)院和新橋醫(yī)院污水處理站出水，沙坪壩水廠、渝中區(qū)水廠、江南水廠、和尚山水廠和西南制藥廠水廠水源水，屠宰場下游地

5、表水和畜禽養(yǎng)殖廠下游地表水水樣。確定受試抗生素為：氧四環(huán)素(Oxytetracycline)、四環(huán)素(Tetracycline)和氯四環(huán)素(Chlortetracycline)。固相萃取(SPE，solidphaseextraction)：經(jīng)預(yù)處理的SAX(500mg/6ml)和HLB(500mg/6ml)固相萃取小柱串聯(lián)過水樣，后者用檸檬酸緩沖液和沖洗后在氮氣流下吹干，甲醇洗脫。洗脫液經(jīng)氮氣吹干后用100μl流動相A定容，-20℃儲存

6、備測。用HPLC/MS對各水樣中經(jīng)SPE所得富集產(chǎn)物中的四環(huán)素進行分析測試。色譜柱為PhenonomenexLunaC18(150×3.0mm,3μm)。以流動相A(含10mM甲酸銨、0.3％甲酸和10％甲醇的水溶液)和流動相B(含10mM甲酸銨、1.0％甲酸的甲醇溶液)進行梯度洗脫，分離受試化合物。離子化采用電噴霧陽離子模式(ESI(+))，監(jiān)測方法為選擇性離子監(jiān)測(SIM)。四環(huán)素的鑒定以保留時間、定量離子與確認(rèn)離子(1或2種)的比

7、值為依據(jù)，其定量通過分析物與內(nèi)標(biāo)物(Simatone)的基峰離子面積比值來計算。 以耐熱性大腸菌群作為指示菌分析重慶市水環(huán)境中微生物對人畜常用十種抗生素的耐藥性并小量制備質(zhì)粒DNA進行質(zhì)粒譜分析。采集的水樣有：受醫(yī)院污水污染地表水樣，屠宰場下游與畜禽養(yǎng)殖場下游地表水樣，污水處理廠進水與出水、嘉陵江地表水，歌樂山山頂泉水。富集分離并鑒定菌株：用經(jīng)美國國家環(huán)保局認(rèn)證的濾膜法對各水樣中耐熱性大腸菌群進行富集分離，并用APILabPlu

8、s微生物分析系統(tǒng)進行菌種鑒定。抗生素敏感性試驗：采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS1997版)推薦的Kirby-Bauer瓊脂擴散法，選擇人畜最常用的青霉素、氨芐青霉素、頭孢他啶、慶大霉素、丁胺卡那霉素、紅霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星等10種抗生素進行藥物敏感性試驗。分析菌株質(zhì)粒譜：用堿裂解法小量制備各分離菌株的質(zhì)粒DNA，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳后用Quantityone系統(tǒng)估算其大小，分析菌株質(zhì)粒譜。 實

9、驗結(jié)果：1.從重慶市5種水體的14個水樣中檢出濃度為0.015～0.214μg/L的氯四環(huán)素、氧四環(huán)素和四環(huán)素。其中有8個水樣至少檢測到1種四環(huán)素，檢出最多的是測到3種四環(huán)素的污水處理廠進水。 2.從7種不同水體分離得到的162株耐熱大腸桿菌中156株(96.3％)為埃希氏大腸桿菌，5株為克雷伯氏菌，1株為亞利桑那沙門氏菌，埃希氏大腸桿菌為優(yōu)勢菌。除3株分離自山泉水的菌僅對青霉素和紅霉素兩種抗生素耐藥外，其它菌株都對3種及3種以

10、上抗生素耐藥，多重耐藥率達到98.1％，對所選十種抗生素都耐受的菌為15株(9.3％)。十種抗生素耐藥率依次為：青霉素100％，紅霉素99.4％，鏈霉素85.2％，氧氟沙星74.5％，環(huán)丙沙星56.8％，諾氟沙星56.2％，慶大霉素47.5％，頭孢他啶42.0％，氨芐青霉素33.3％，丁胺卡那霉素22.2％。不同水體分離菌株對氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素、鏈霉素等5種抗生素的耐藥率有顯著性的差異(P＜0.005)。不同水體

11、的分離株耐藥率兩兩比較發(fā)現(xiàn)：除嘉陵江地表水和屠宰場、畜禽養(yǎng)殖場下游地表水外，其它不同水體間微生物對1～5種抗生素的耐藥率具有顯著性差異(P＜0.01250)。污水處理廠進水和出水分離菌株的抗生素耐藥率無顯著性差異(P＞0.01250)。 3.162株分離菌株中有92株(56.8％)提取到大小為0.90～158.83Kb、數(shù)量為1～6個的質(zhì)粒，有81種質(zhì)粒譜型。70株(43.2％)未提取到質(zhì)粒的細(xì)菌中對2種抗生素耐受的有3株，其余

12、67株均對3種及3種以上抗生素耐受(多重耐藥)；具有相同質(zhì)粒譜型的菌株耐藥譜都不相同；未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒數(shù)量的多少與抗生素耐受種類多少間有明顯相關(guān)性。 結(jié)論與展望：1.SPE與HPLC/MS適于對重慶市水環(huán)境中抗生素污染進行動態(tài)監(jiān)測。2.重慶市多種水體中普遍存在痕量水平的四環(huán)素類抗生素，應(yīng)進行周密布點，選擇出具代表性的抗生素，對重慶市水環(huán)境中抗生素污染進行長期監(jiān)測。3.重慶市水環(huán)境中微生物的抗生素耐藥性已普遍存在，形成原因有待深入研究。

13、4.不同水體分離的耐熱性大腸菌群對氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素和鏈霉素的耐藥性有顯著性差異，可以這五種抗生素為代表進一步研究重慶地區(qū)耐熱大腸菌群各宿主(如人、各種家禽家畜)糞便及各種水體中耐熱性大腸菌群的抗生素耐藥性并建立相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，為以ARA進行微生物污染源追蹤的可行性研究奠定基礎(chǔ)。5.在重慶市醫(yī)院污水、污水處理廠出水和嘉陵江地表水的水質(zhì)監(jiān)測項目中加入微生物耐藥性指標(biāo)具有重要意義。6.未發(fā)現(xiàn)耐熱性大腸菌群質(zhì)粒譜與耐藥譜間