阿司匹林選擇性清除結(jié)直腸癌干細(xì)胞及其分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　結(jié)直腸癌為常見多發(fā)的惡性腫瘤，據(jù)報(bào)告全美國2012年結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)及死亡病例數(shù)均居全部惡性腫瘤的第3位。盡管我國結(jié)直腸癌基礎(chǔ)研究與早期干預(yù)有較大進(jìn)步，但其發(fā)病率與死亡率仍呈明顯上升趨勢，日益成為嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病。已有研究證明結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞(CancerStem Cell; CSC)，CSC是一群具有很強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，雖在腫瘤細(xì)胞中所占比例很小，但在腫瘤發(fā)生，治

2、療抵抗，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。因此治療結(jié)直腸癌關(guān)鍵在于清除結(jié)直腸癌干細(xì)胞(Colorectal Cancer StemCell，CCSC)。
　　小分子化合物阿司匹林(Aspirin)是世界上使用最多，使用時間最長，且不會產(chǎn)生藥物依賴性的非甾體抗炎藥。流行病學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)表明，Aspirin除了用于解熱、抗血小板凝聚等，還可防治包括結(jié)直腸癌、食道癌、肺癌在內(nèi)的多種腫瘤。大量證據(jù)也表明阿司匹林能夠明顯降低結(jié)直腸癌發(fā)生率和死亡率、改

3、善患者預(yù)后，但其作用機(jī)制不明。最近有文獻(xiàn)報(bào)道非甾體抗炎藥（吲哚美辛）能夠降低結(jié)直腸癌細(xì)胞系中CCSC的數(shù)量。但是，Aspirin是否能抑制CCSC及其具體的分子調(diào)控機(jī)制尚未見報(bào)道。
　　因此，深入研究Aspirin對CCSC效應(yīng)有助于拓展Aspirin的臨床應(yīng)用，可為篩選結(jié)直腸癌治療的潛在分子靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)更加高效抗腫瘤藥物提供理論基礎(chǔ)，具有重要的臨床意義，是當(dāng)前迫切需要探索和解決的重要科學(xué)前沿問題。
　　研究方法：
　　

4、利用無血清培養(yǎng)體系從原代結(jié)直腸癌細(xì)胞及ATCC標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中富集CCSC，并對其生物學(xué)特性（克隆球形成能力，耐藥性，成瘤性，腫瘤干細(xì)胞比例，干性基因表達(dá)水平）等進(jìn)行鑒定。在培養(yǎng)體系中加入不同濃度梯度的Aspirin，比較處理前后CCSC生物學(xué)特性的改變。利用MTS實(shí)驗(yàn)檢測Aspirin對CCSC的殺傷效應(yīng)是否具有選擇性，并免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析其通過何種方式（凋亡/自噬）選擇性抑制CCSC。還利用定量PCR檢測CCSC和non-CCSC

5、中凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平，篩選Aspirin通過何種凋亡因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步采用封閉性抗體抑制相關(guān)通路后檢測Aspirin對CCSC的影響。同時還應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)從表觀遺傳學(xué)角度探討了該凋亡因子的上游調(diào)控機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　　1.利用無血清培養(yǎng)技術(shù)富集的CCSC具有典型的腫瘤干細(xì)胞特性，Aspirin能抑制CCSC的腫瘤干細(xì)胞特性。
　　利用無血清培養(yǎng)體系從原代結(jié)直腸癌細(xì)胞及ATCC標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系HT29中成

6、功富集了CCSC，與non-CCSC比較，CCSC克隆球形成能力明顯加強(qiáng)，干性基因(Sox2，Oct4，Nanog，Notch1，Bmi-1和ALDH1)的表達(dá)水平明顯升高，干細(xì)胞標(biāo)記ALDH1的表達(dá)水平明顯增高，對化療藥物奧沙利鉑(OXA)的耐藥性明顯增加，體內(nèi)成瘤性也明顯增強(qiáng)。CCSC中加入不同濃度梯度的Aspirin(0，2.5，5.0，10.0mM)，與對照組比較，Aspirin能抑制克隆球的數(shù)量和減少其直徑，降低干性基因(So

7、x2，Oct4，Nanog，Notch1，Bmi-1和ALDH1)的表達(dá)水平以及干細(xì)胞標(biāo)記ALDH1的表達(dá)水平，增加CCSC對OXA的敏感性，且這些效應(yīng)呈明顯的劑量依賴性。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)也表明Aspirin能抑制CCSC的生長，降低其成瘤體積。這些結(jié)果證實(shí)在Aspirin能明顯地抑制CCSC干細(xì)胞特性。
　　2.Aspirin通過上調(diào)FasL選擇性誘導(dǎo)CCSC凋亡。
　　既然Aspirin能明顯地抑制CCSC，那么Aspiri

8、n對CCSC和non-CCSC的抑制作用是否存在著差異？我們的研究證實(shí)Aspirin選擇性抑制了CCSC。目前的研究報(bào)道Aspirin主要是通過誘導(dǎo)凋亡或自噬抑制腫瘤細(xì)胞，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aspirin選擇性地誘導(dǎo)了CCSC的凋亡而不是自噬。凋亡分為外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑，我們的研究證實(shí)Aspirin上調(diào)CCSC中的FasL，通過外源性的凋亡途徑介導(dǎo)其凋亡。而在non-CCSC中FasL，F(xiàn)as均出現(xiàn)下調(diào)，因此選擇性地誘導(dǎo)了CCS

9、C的凋亡。并且利用封閉性抗體封閉FasL后，CCSC的存活率明顯增加，凋亡細(xì)胞明顯減少。
　　3.Aspirin通過非COX-2途徑上調(diào)FasL.
　　Aspirin抗結(jié)直腸癌的經(jīng)典機(jī)制是認(rèn)為Aspirin降低了COX-2的酶活性進(jìn)而影響了PGE2的合成，我們的研究證實(shí)加入Aspirin后CCSC中的COX-2的酶活性出現(xiàn)了降低，但是通過特異性的siRNA抑制COX-2，或者小分子抑制劑NS-398并不能誘導(dǎo)CCSC的凋亡，

10、也不能上調(diào)FasL的表達(dá)。另一方面，在CCSC中同時加入Aspirin和PGE2并不能降低凋亡的比率及下調(diào)FasL的表達(dá)，這些證據(jù)提示Aspirin通過非COX-2途徑上調(diào)FasL。
　　4.Aspirin通過乙?；M蛋白H3來上調(diào)FasL。
　　我們比較了非甾體抗炎藥包括（水楊酸，Aspirin，吲哚美辛，布諾芬，舒林酸）對CCSC中FasL的影響，發(fā)現(xiàn)僅Aspirin能上調(diào)FasL的表達(dá)。而比較這些非甾體抗炎藥結(jié)構(gòu)，我們

11、發(fā)現(xiàn)Aspirin中具有乙?；鶊F(tuán)，提示乙酰化在上調(diào)FasL中起著重要的作用。去乙?；敢种苿㏕SA處理CCSC后FasL水平明顯上調(diào)。分析組蛋白乙?；潭群蟀l(fā)現(xiàn)僅組蛋白H3乙?；潭壬?，且升高的乙酰化組蛋白H3促進(jìn)了FasL的轉(zhuǎn)錄。
　　研究結(jié)論：
　　Aspirin能顯著抑制CCSC的腫瘤干細(xì)胞特性，同時通過選擇性上調(diào)FasL誘導(dǎo)其凋亡來抑制CCSC。 Aspirin上調(diào)FasL是非COX-2依賴的，通過乙酰化組蛋白H3