SIRT1在結(jié)直腸癌中的表達與作用機制研究.pdf

1、背景：
　　結(jié)直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在歐美等西方發(fā)達國家的發(fā)病率位居所有腫瘤第二位，并在發(fā)展中國家呈逐年上升的趨勢;近二十年來，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們的生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，且發(fā)病年齡逐漸年輕化。2012年中國腫瘤登記年報的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2009年中國結(jié)直腸癌位居國內(nèi)腫瘤發(fā)病率的第3位和死亡率的第5位，北京、上海等一線城市的結(jié)直腸癌發(fā)病率已經(jīng)接近甚至高于發(fā)達國家水平。結(jié)直

2、腸癌已經(jīng)成為嚴重危害人們的身體健康、降低患者生活質(zhì)量的常見病，同時也給社會與家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。
　　結(jié)直腸癌的發(fā)病機制與環(huán)境、遺傳、疾病等多種因素有關(guān)，涉及多個癌基因的激活和抑癌基因的失活。目前通過早期篩查技術(shù)，能夠發(fā)現(xiàn)一些早期結(jié)直腸癌患者，從而有效提高患者的存活率、降低病死率;另外各種新型化療藥物和分子靶向藥物不斷面世提高了臨床療效，然而晚期結(jié)直腸癌仍然所占比例較高、治療效果差，5年生存率依然很低。因此尋找新的早期診斷標(biāo)志

3、物及新的治療靶點，進而提高療效改善預(yù)后具有重要臨床價值和社會效益。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子2(sir2)是最初在芽殖酵母中發(fā)現(xiàn)的一種抗衰老基因，其編碼的小分子蛋白Sirt2具有NAD+依賴的組蛋白去乙?；富钚裕c壽命延長相關(guān)。SIRT1是Sirt2在哺乳動物中同源性最高的一個類似物，它參與細胞的能量代謝、增殖衰老、炎性反應(yīng)、神經(jīng)保護、腫瘤形成等多個過程。
　　SIRT1功能主要通過去乙?；瘜虮磉_起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵蛋白來實現(xiàn)

4、。SIRT1不僅可以去乙?；湍妇筒溉閯游镏卸喾N組蛋白特殊的賴氨酸殘基，如H1(K26)，H3(K9，K14)，H4(K16)等，而且SIRT1還可以使一些非組蛋白去乙?；?。經(jīng)典抑癌蛋白P53是SIRT1明確的下游蛋白，SIRT1能夠通過去乙酰化對P53的活性和表達進行調(diào)控，從而參與由P53介導(dǎo)的細胞增殖與凋亡。超過50％的人類腫瘤中P53發(fā)生突變，突變P53由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榇侔┗颍琒IRT1可能在P53發(fā)生突變過程中起到重要作用。

5、在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用其他一些非組蛋白也可被SIRT1去乙?；?，例如HIF-1α、HIF-2α，β-catenin等;有報道SIRT1可以通過去乙?；?catenin，抑制結(jié)腸多發(fā)性息肉腺瘤的增殖。
　　SIRT1在結(jié)直腸癌的作用機制以及亞細胞定位、亞細胞定位與核漿穿梭的關(guān)系尚有爭議。有報道指出，磷酸化能夠調(diào)控SIRT1的去乙酰化活性和核漿穿梭，有關(guān)SIRT1磷酸化作用在結(jié)直腸癌中的研究鮮見報道，因此我們在本實驗研究

6、的第一部分著重分析Phospho-SIRT1與SIRT1在結(jié)直腸癌中表達與定位，以及探討SIRT1磷酸化在腫瘤形成中的作用。關(guān)于SIRT1、P53與β-catenin在結(jié)直腸癌中的表達與臨床病理特征的關(guān)系，以及SIRT1與P53、β-catenin的相關(guān)性，本實驗研究第二部分將予以探討分析。
　　第一部分 SIRT1在結(jié)直腸癌中亞細胞定位及其磷酸化研究
　　目的:
　　本實驗研究通過檢測SIRT1、Phospho-SI

7、RT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達水平及亞細胞定位情況，以及SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的轉(zhuǎn)錄水平，分析Phospho-SIRT1與SIRT1之間的相關(guān)性，探討磷酸化在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　采用免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法檢測結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中SIRT1和Phospho-SIRT1蛋白表達情況及亞細胞定位情況;采用Real-TimePCR方法檢測結(jié)直腸癌組織和

8、癌旁正常組織中SIRT1 mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.SIRT1在癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P＜0.05)，SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中均完全定位于細胞核內(nèi)，無胞漿定位;
　　2.Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中均完全定位于細胞核內(nèi)，無胞漿定位;Phospho-SIRT1在癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P＜0.05)。
　　3.Phospho-SIRT1

9、與SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達均呈正相關(guān)(r=0.8717，r=0.7354)，Phospho-SIRT1/SIRT1比值在癌組織中高于癌旁正常組織。
　　4.SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的轉(zhuǎn)錄水平無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.SIRT1、Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌組織中的表達均高于癌旁正常粘膜組織，推測SIRT1與Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌的形成過程中具有促癌作用

10、。
　　2.SIRT1與Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常粘膜組織中只定位于細胞核內(nèi)，無胞漿定位;提示Phospho-SIRT1并不代表SIRT1的核漿穿梭部分，可能在體內(nèi)具有多種因素的復(fù)雜調(diào)控機制決定SIRT1的亞細胞定位。
　　3.Phospho-SIRT1與SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常粘膜組織中的表達水平均呈正相關(guān)，而且Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中均定位于細胞核內(nèi)，結(jié)直

11、腸癌組織中Phospho-SIRT1/SIRT1的比值高于癌旁正常組織，推測Phospho-SIRT1可能決定了SIRT1在組織中的作用，SIRT1的磷酸化具有促癌作用。
　　4.結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的SIRT1 mRNA表達水平無差異性，提示SIRT1蛋白表達水平與其mRNA轉(zhuǎn)錄水平無關(guān)，推測SIRT1基因表達受到顯著的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。
　　第二部分 SIRT1、P53及β-catenin在結(jié)直腸癌中的表達及臨床病理意

12、義
　　目的:
　　本研究通過檢測沉默信息調(diào)節(jié)因1（SIRT1）在結(jié)直腸癌組織以及癌旁正常粘膜組織中的表達水平，SIRT1與P53、β-catenin在結(jié)直腸癌組織的表達相關(guān)性，探討SIRT1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　采用免疫組織化學(xué)化法檢測76例結(jié)直腸癌組織中的SIRT1、P53及β-catenin的表達及30例癌旁正常粘膜組織中SIRT1表達水平，分析SIRT1在結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織

13、表達差異性，分析三者與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系以及SIRT1與P53、β-catenin表達相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中均完全定位于細胞核內(nèi)，未見胞漿定位;
　　2.SIRT1在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的陽性表達率分別為64.47％(49/76)和36.67％(11/30)。SIRT1在癌組織和正常組織中的平均染色評分分別為4.667±0.374和2.650±0.425。經(jīng)統(tǒng)

14、計學(xué)分析顯示，SIRT1在結(jié)直腸癌組織中的表達高于癌旁正常粘膜組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　3.SIRT1的表達與結(jié)直腸癌浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，且隨著浸潤深度加深、分化程度越低、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期升高時表達升高(P＜0.05)。P53在結(jié)直腸癌組織中高表達與腫瘤浸潤深度、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，β-catenin的高表達與腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(

15、P＜0.05);
　　4.SIRT1表達和P53的表達呈正相關(guān)(R=0.287，P=0.009); SIRT1表達和β-catenin表達之間無明顯相關(guān)性(R=0.213，P=0.058)。
　　結(jié)論:
　　1.SIRT1在結(jié)直腸癌組織中高表達，推測SIRT1在結(jié)直腸癌的形成過程中具有促癌作用。
　　2.SIRT1、P53、β-catenin與結(jié)直腸癌的臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，提示聯(lián)合檢測SIRT1、P53以及β

16、-catenin的表達對判斷患者預(yù)后具有一定的意義。
　　3.SIRT1在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達和P53的表達呈正相關(guān)(R=0.287，P=0.009)，推測SIRT1可能是結(jié)直腸癌的一種促癌基因，其機制可能通過去乙?；疨53來調(diào)控P53活性和表達，從而抑制了P53介導(dǎo)的細胞凋亡從而參與了結(jié)直腸癌的進展。
　　4.SIRT1在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達和β-catenin之間無明顯相關(guān)性(R=0.213，P=0.058)，未