SIRT1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在歐美等西方發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率位居所有腫瘤第二位，并在發(fā)展中國(guó)家呈逐年上升的趨勢(shì);近二十年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，且發(fā)病年齡逐漸年輕化。2012年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2009年中國(guó)結(jié)直腸癌位居國(guó)內(nèi)腫瘤發(fā)病率的第3位和死亡率的第5位，北京、上海等一線城市的結(jié)直腸癌發(fā)病率已經(jīng)接近甚至高于發(fā)達(dá)國(guó)家水平。結(jié)直

2、腸癌已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人們的身體健康、降低患者生活質(zhì)量的常見(jiàn)病，同時(shí)也給社會(huì)與家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制與環(huán)境、遺傳、疾病等多種因素有關(guān)，涉及多個(gè)癌基因的激活和抑癌基因的失活。目前通過(guò)早期篩查技術(shù)，能夠發(fā)現(xiàn)一些早期結(jié)直腸癌患者，從而有效提高患者的存活率、降低病死率;另外各種新型化療藥物和分子靶向藥物不斷面世提高了臨床療效，然而晚期結(jié)直腸癌仍然所占比例較高、治療效果差，5年生存率依然很低。因此尋找新的早期診斷標(biāo)志

3、物及新的治療靶點(diǎn)，進(jìn)而提高療效改善預(yù)后具有重要臨床價(jià)值和社會(huì)效益。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子2(sir2)是最初在芽殖酵母中發(fā)現(xiàn)的一種抗衰老基因，其編碼的小分子蛋白Sirt2具有NAD+依賴(lài)的組蛋白去乙?；富钚?，與壽命延長(zhǎng)相關(guān)。SIRT1是Sirt2在哺乳動(dòng)物中同源性最高的一個(gè)類(lèi)似物，它參與細(xì)胞的能量代謝、增殖衰老、炎性反應(yīng)、神經(jīng)保護(hù)、腫瘤形成等多個(gè)過(guò)程。
　　SIRT1功能主要通過(guò)去乙?；瘜?duì)基因表達(dá)起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)

4、。SIRT1不僅可以去乙?；湍妇筒溉閯?dòng)物中多種組蛋白特殊的賴(lài)氨酸殘基，如H1(K26)，H3(K9，K14)，H4(K16)等，而且SIRT1還可以使一些非組蛋白去乙?；?。經(jīng)典抑癌蛋白P53是SIRT1明確的下游蛋白，SIRT1能夠通過(guò)去乙?；瘜?duì)P53的活性和表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而參與由P53介導(dǎo)的細(xì)胞增殖與凋亡。超過(guò)50％的人類(lèi)腫瘤中P53發(fā)生突變，突變P53由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榇侔┗颍琒IRT1可能在P53發(fā)生突變過(guò)程中起到重要作用。

5、在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用其他一些非組蛋白也可被SIRT1去乙酰化，例如HIF-1α、HIF-2α，β-catenin等;有報(bào)道SIRT1可以通過(guò)去乙酰化β-catenin，抑制結(jié)腸多發(fā)性息肉腺瘤的增殖。
　　SIRT1在結(jié)直腸癌的作用機(jī)制以及亞細(xì)胞定位、亞細(xì)胞定位與核漿穿梭的關(guān)系尚有爭(zhēng)議。有報(bào)道指出，磷酸化能夠調(diào)控SIRT1的去乙酰化活性和核漿穿梭，有關(guān)SIRT1磷酸化作用在結(jié)直腸癌中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)研究

6、的第一部分著重分析Phospho-SIRT1與SIRT1在結(jié)直腸癌中表達(dá)與定位，以及探討SIRT1磷酸化在腫瘤形成中的作用。關(guān)于SIRT1、P53與β-catenin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，以及SIRT1與P53、β-catenin的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)研究第二部分將予以探討分析。
　　第一部分 SIRT1在結(jié)直腸癌中亞細(xì)胞定位及其磷酸化研究
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)檢測(cè)SIRT1、Phospho-SI

7、RT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平及亞細(xì)胞定位情況，以及SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的轉(zhuǎn)錄水平，分析Phospho-SIRT1與SIRT1之間的相關(guān)性，探討磷酸化在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　采用免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中SIRT1和Phospho-SIRT1蛋白表達(dá)情況及亞細(xì)胞定位情況;采用Real-TimePCR方法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和

8、癌旁正常組織中SIRT1 mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.SIRT1在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P＜0.05)，SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中均完全定位于細(xì)胞核內(nèi)，無(wú)胞漿定位;
　　2.Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中均完全定位于細(xì)胞核內(nèi)，無(wú)胞漿定位;Phospho-SIRT1在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P＜0.05)。
　　3.Phospho-SIRT1

9、與SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.8717，r=0.7354)，Phospho-SIRT1/SIRT1比值在癌組織中高于癌旁正常組織。
　　4.SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.SIRT1、Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)均高于癌旁正常粘膜組織，推測(cè)SIRT1與Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌的形成過(guò)程中具有促癌作用

10、。
　　2.SIRT1與Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常粘膜組織中只定位于細(xì)胞核內(nèi)，無(wú)胞漿定位;提示Phospho-SIRT1并不代表SIRT1的核漿穿梭部分，可能在體內(nèi)具有多種因素的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制決定SIRT1的亞細(xì)胞定位。
　　3.Phospho-SIRT1與SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)水平均呈正相關(guān)，而且Phospho-SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中均定位于細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)直

11、腸癌組織中Phospho-SIRT1/SIRT1的比值高于癌旁正常組織，推測(cè)Phospho-SIRT1可能決定了SIRT1在組織中的作用，SIRT1的磷酸化具有促癌作用。
　　4.結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的SIRT1 mRNA表達(dá)水平無(wú)差異性，提示SIRT1蛋白表達(dá)水平與其mRNA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)關(guān)，推測(cè)SIRT1基因表達(dá)受到顯著的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。
　　第二部分 SIRT1、P53及β-catenin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床病理意

12、義
　　目的:
　　本研究通過(guò)檢測(cè)沉默信息調(diào)節(jié)因1（SIRT1）在結(jié)直腸癌組織以及癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)水平，SIRT1與P53、β-catenin在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)相關(guān)性，探討SIRT1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　采用免疫組織化學(xué)化法檢測(cè)76例結(jié)直腸癌組織中的SIRT1、P53及β-catenin的表達(dá)及30例癌旁正常粘膜組織中SIRT1表達(dá)水平，分析SIRT1在結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織

13、表達(dá)差異性，分析三者與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系以及SIRT1與P53、β-catenin表達(dá)相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.SIRT1在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中均完全定位于細(xì)胞核內(nèi)，未見(jiàn)胞漿定位;
　　2.SIRT1在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.47％(49/76)和36.67％(11/30)。SIRT1在癌組織和正常組織中的平均染色評(píng)分分別為4.667±0.374和2.650±0.425。經(jīng)統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)分析顯示，SIRT1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常粘膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　3.SIRT1的表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，且隨著浸潤(rùn)深度加深、分化程度越低、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期升高時(shí)表達(dá)升高(P＜0.05)。P53在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，β-catenin的高表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(

15、P＜0.05);
　　4.SIRT1表達(dá)和P53的表達(dá)呈正相關(guān)(R=0.287，P=0.009); SIRT1表達(dá)和β-catenin表達(dá)之間無(wú)明顯相關(guān)性(R=0.213，P=0.058)。
　　結(jié)論:
　　1.SIRT1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，推測(cè)SIRT1在結(jié)直腸癌的形成過(guò)程中具有促癌作用。
　　2.SIRT1、P53、β-catenin與結(jié)直腸癌的臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，提示聯(lián)合檢測(cè)SIRT1、P53以及β

16、-catenin的表達(dá)對(duì)判斷患者預(yù)后具有一定的意義。
　　3.SIRT1在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)和P53的表達(dá)呈正相關(guān)(R=0.287，P=0.009)，推測(cè)SIRT1可能是結(jié)直腸癌的一種促癌基因，其機(jī)制可能通過(guò)去乙?；疨53來(lái)調(diào)控P53活性和表達(dá)，從而抑制了P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從而參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展。
　　4.SIRT1在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)和β-catenin之間無(wú)明顯相關(guān)性(R=0.213，P=0.058)，未