T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤基因重排及T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子受體表達(dá)模式的研究.pdf

1、淋巴瘤的病理診斷被公認(rèn)為是臨床病理中難度最大的,僅靠組織形態(tài)學(xué)以及免疫組化結(jié)果有時容易造成誤診及漏診。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,分子克隆分析無論是在淋巴瘤的初次診斷還是以后的隨訪中日益重要并且逐漸成熟,國外,特別是免疫球蛋白基因的克隆分析,已經(jīng)用于B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphoma,B-NHL)的常規(guī)病理診斷。T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-Hodgkin iymphoma,T-NHL)

2、是一種相對較少見且高度異質(zhì)性的惡性淋巴瘤,目前國內(nèi)外對T-NHL的病理診斷還不太樂觀。T-NHL的病理診斷要解決兩個問題,一是不是T-NHL?二是哪一種類型的T-NHL?也就是T-NHL的診斷和分類問題。關(guān)于第一個問題,由于T-NHL其形態(tài)多變以及免疫學(xué)上無克隆性標(biāo)記,主張對所有的T細(xì)胞增殖性疾病進(jìn)行分子克隆性基因重排分析,尤其是T細(xì)胞富裕的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤?？寺》治隽馨土龅脑硎腔谒袗盒粤馨图?xì)胞都有一個共同的克隆起源。目前淋巴

3、瘤的分子病理診斷中,聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction,PCR)因其快速、簡單、高效、廉價,敏感度高以及對DNA的質(zhì)和量要求不高等優(yōu)點而逐步取代了Southern blot。一般來說,PCR檢測的高靈敏度期望是從新鮮的或冰凍的樣本中分離得到DNA,而從福爾馬林固定石蠟包埋(formalin fixed and paraffin embedded,FFPE)的組織樣本中分離得到的DNA使其敏感性有所降低。

4、不幸的是,在大部分的診斷病例以及回顧性研究中,僅能得到FFPE的組織樣本。從FFPE的組織樣本中分離出的DNA含有許多斷裂的并伴有化學(xué)修飾的短小靶序列,不利于分子診斷。如何提高FFPE樣本檢測的敏感性是研究者面對的一個難題。另一方面不同文獻(xiàn)中所選擇的引物,PCR循環(huán)參數(shù)以及PCR產(chǎn)物分析方法都不盡相同,檢測結(jié)果也有差異。因此,如何找到適合于常規(guī)臨床病理診斷的標(biāo)準(zhǔn)程序是研究者面對的另一個難題。實際上與新鮮的或冰凍的樣本相比,克隆分析FFP

5、E樣本的難度在于需要更多的實驗,本研究獲省科技廳項目(001110425)、浙江省自然科學(xué)基會項目(Y205292)和浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金(2006A084)資助其與大部分的體細(xì)胞基因PCR擴(kuò)增相比更為復(fù)雜。以PCR為基礎(chǔ)的克隆分析雖不是一項新穎的方法,但現(xiàn)有發(fā)表的文章很少有改變PCR參數(shù)擴(kuò)增FFPE樣本的DNA模板的研究分析。關(guān)于第二個問題,分化標(biāo)記物表達(dá)的研究表明大多數(shù)T-NHL是由胸腺后T細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化發(fā)展而來的,因此這些惡

6、性腫瘤被稱為外周T細(xì)胞淋巴瘤(periferal T celllymphomas,PTCLs)。PTCLs一群高度異質(zhì)性的惡性淋巴瘤,其診斷、分類及分子發(fā)病機(jī)制的研究一直是腫瘤病理學(xué)中最為困難和最有爭議的領(lǐng)域之一。最新的2001年WHO分類標(biāo)準(zhǔn),已經(jīng)分化出了一些獨立存在的腫瘤實體,如腸病相關(guān)性T細(xì)胞淋巴瘤(enteropathy type T cell lymphoma,ETTCL),間變性大細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤(anaplasticla

7、gre T cell lymphoma,ALCL),血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-celllymphoma,AITL),鼻型T/NK細(xì)胞淋巴瘤以及肝脾γδT細(xì)胞淋巴瘤等等,除此之外,一種新PTCLs被分出,即非特指外周T細(xì)胞淋巴瘤(periferal T cell lymphomas,unspecified,PTCL-U),然而這一術(shù)語僅用來描述一類異質(zhì)性的淋巴瘤,而這類淋巴瘤有不同的臨床特征,組

8、織學(xué)特點,基因改變,治療反應(yīng)以及相應(yīng)的預(yù)后。因此,詳細(xì)的PTCLs分類,尤其是PTCL-U有待于進(jìn)一步的澄清。迄今為止,T-NHL的分類大致基于形態(tài)學(xué)或臨床準(zhǔn)則。最近研究表明,正常T細(xì)胞亞群趨化因子受體的表達(dá)模式與該細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子相關(guān),CCR3選擇性表達(dá)在人類或小鼠的Th2細(xì)胞,CXCR3選擇表達(dá)在Th1細(xì)胞?；谝陨显?本實驗以FFPE中T細(xì)胞受體(TCR)γ基因重排為研究對象,選用TCR多重引物,通過優(yōu)化DNA提取以及PC

9、R多個參數(shù)分析T-NHL中TCRγ基因重排,以建立PCR擴(kuò)增中不同變量性能改變的重要意義。另選用一對TCRβ通用性引物作為TCRγ多重引物的補(bǔ)充和比較,同時聯(lián)合最常用以及檢測率較高的FR3A和FR2A通用性引物檢測T-NHL中IgH基因的克隆性重排在本實驗室T-NHL中的檢測率。我們研究趨化因子受體中Th1相關(guān)標(biāo)記CXCR3和Th2細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記CCR3在T-NHL中表達(dá)以評估其與臨床病理的關(guān)系。材料與方法1材料(1)T-NHL標(biāo)本:收集

10、1997-2008年我醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及省內(nèi)其它醫(yī)院的T-NHL標(biāo)53例。全部標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4～5μm連續(xù)切片,除常規(guī)HE染色外,采用LCA(2B11,DAKO)、CD45RO(UCHL1,DAKO)、CD20(L26,DAKO)、CD30(Ber-H2,DAKO)免疫組化確定腫瘤的免疫表型。按照2001年WHO關(guān)于淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對所有病例進(jìn)行分類:同時參照1992年Kail標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)高低級別分級。

11、(2)對照組標(biāo)本:收集反應(yīng)性增生的淋巴組織石蠟標(biāo)本4例,其中1例為淋巴結(jié),3例為扁桃體。(3)Jurkat細(xì)胞:人類T細(xì)胞白血病細(xì)胞株,培養(yǎng)條件:選擇RPMI1640(含10％胎牛血清)培養(yǎng)基,放入37℃,5%CO2～95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞生長接近融合成簇,離心收集后待用。2方法(1)免疫組織化學(xué)檢測T-NHL中LCA,CD45RO,CD20,CD30的表達(dá),確定腫瘤免疫表型。(2)選取6例T-NHL和4例反應(yīng)性增生的淋

12、巴組織,根據(jù)脫蠟時間與脫蠟溫度不同分為兩組,然后常規(guī)蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蠟組織DNA;TCRγ基因重排為研究對象,選用多重TCRγ引物,優(yōu)化PCR循環(huán)參數(shù)。(3)采用PCR方法,聯(lián)合TCRγ,TCRβ及FR3A、FR2A引物,檢測53例T-NHL標(biāo)本TCRγ、TCRβ及IgH基因克隆性重排,產(chǎn)物先2%瓊脂糖電泳初篩,后行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。(4)選擇Th1相關(guān)的細(xì)胞因子受體CXCR3和Th2相關(guān)的細(xì)胞因子受體CCR3,

13、運(yùn)用免疫組化方法檢測這兩種細(xì)胞因子受體在45例T-NHL中表達(dá)水平,評估其與臨床病理的關(guān)系。(5)統(tǒng)計學(xué)處理:實驗結(jié)果均使用SPSS16.0 for Windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。3結(jié)果(1)根據(jù)免疫組織化學(xué)分型、組織學(xué)改變以及臨床資料,同時參照2001年WHO關(guān)于淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對53例T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分類,分為27例外周T細(xì)胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U),12例腸病相關(guān)性T細(xì)胞淋巴瘤(ETTCL),8例間變性大細(xì)胞T

14、細(xì)胞淋巴瘤(ALCL),6皮下脂膜炎性T細(xì)胞淋巴瘤(SCPTCL)。(2)脫蠟時間長和脫蠟溫度高的一組DNA質(zhì)量以及產(chǎn)量較高。(3)FFPE樣本TCRγ多重引物擴(kuò)增中:TCRγA,B管40個循環(huán)達(dá)到最佳擴(kuò)增效果;TCRγA管退貨溫度在50.9℃～65.5℃都可達(dá)到滿意的擴(kuò)增效果,而TCRγB管則需在50.9℃～56.7℃;TCRγA,B管所需引物量50pmol以上,Mg2+終濃度1.25～1.75 mM,dNTPs終濃度100～200

15、uM。(4)53例T-NHL中。采用優(yōu)化的TCRγA,B管多重引物克隆性TCRγ基因重排檢測率為62.3%(33/53),TCRβD2-J2通用性引物的檢洲率為41.9%(23/53),聯(lián)合TCRβ通用性引物,總檢測率為66.0%(35/53)。(5)聯(lián)合TCRγA,B管及FR3A、FR2A引物,7.6%(4/53)T-NHL檢測到雙重重排,免疫組化結(jié)果提示這4例均為T細(xì)胞表型。病理類型分別為3例外周T細(xì)胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U)

16、與1例間變形性大細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)。(6)免疫組化檢測45例T-NHL中CXCR3與CCR3表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR3與CCR3總的表達(dá)率為24.4%,不同病理類型之間表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。4結(jié)論(1)延長脫蠟時間以及提高脫蠟溫度有助于提高FFPE樣本中DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量。(2)對TCRγ多重引物增加PCR循環(huán)次數(shù)有助于提高劣質(zhì)DNA的擴(kuò)增率,增加引物濃度,輕微增加的Mg2+濃度結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)量dNTPs可以改善TC

17、Rγ基因的克隆檢測。(3)在TCRG多重引物優(yōu)化過程中,我們的實驗有助于確定哪一個參數(shù)以及如何改變來減少假陽性或假陰性。(4)采用優(yōu)化的TCRγA,B管多重引物,克隆性TCRγ基因重排在T-NHL中檢測率高于TCRβ通用性引物D2-J2,但聯(lián)合TCRβ通用性引物D2-J2,可以提高總檢測率。(5)基因重排與淋巴瘤細(xì)胞的免疫表型并不一致。不能通過基因重排來確定T、B細(xì)胞系來源,除非必須同時進(jìn)行Ig和TCR基因重排,排除其一才能確定其細(xì)胞系