毛囊隆突區(qū)細(xì)胞生物學(xué)性狀及β-catenin在毛囊生長分化中作用的初步研究.pdf

1、毛囊是皮膚重要而復(fù)雜的附屬結(jié)構(gòu)，從內(nèi)向外依次由毛干、內(nèi)根鞘和外根鞘組成。隆突區(qū)是毛囊外根鞘向外隆起的部分，位于皮脂腺導(dǎo)管開口的下方，是立毛肌的附著處。早期研究利用3H-TdR標(biāo)記的方法觀察皮膚中標(biāo)記物的分布，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)標(biāo)記保留細(xì)胞集中在毛囊外根鞘的隆突區(qū)，并且當(dāng)毛囊受X線處理或毛囊下段被去除后仍能再形成完整的毛囊，因此，人們認(rèn)為皮膚中多能干細(xì)胞存在于毛囊上段隆突區(qū)，稱為毛囊干細(xì)胞(HFSC)。許多研究發(fā)現(xiàn)毛囊隆突區(qū)干細(xì)胞參與毛囊周期的

2、維持以及組織的形成，隆突區(qū)細(xì)胞具有多向分化潛能，不僅能向下遷移形成毛球部，而且能向上遷移參與表皮更新和毛囊、皮脂腺的再生。目前，毛囊干細(xì)胞定位于毛囊隆突區(qū)已經(jīng)得到廣泛地認(rèn)同，并認(rèn)為在上皮各類干細(xì)胞中，隆突區(qū)的毛囊干細(xì)胞群是最具潛力的干細(xì)胞庫。但是直到現(xiàn)在對毛囊隆突區(qū)培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)仍了解甚少，妨礙了人們對毛囊干細(xì)胞在毛囊生長、損傷修復(fù)以及腫瘤發(fā)生等方面研究的深入。本實(shí)驗(yàn)中采用改良消化法得到完整的毛囊，根據(jù)隆突區(qū)形態(tài)特征，在體外顯微切

3、割分離毛囊隆突區(qū)，成功地進(jìn)行細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)，并在培養(yǎng)狀態(tài)下觀察細(xì)胞的生長特性及表達(dá)特征，同時通過檢測組織中表面標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)毛囊隆突區(qū)是毛囊干細(xì)胞的棲息地。 β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一種胞內(nèi)糖蛋白，具有雙重功能。一是作為附著連接的組成部分，與鈣粘蛋白結(jié)合形成復(fù)合體參與細(xì)胞間連接；二是作為信號分子，是wnt信號途徑的重要環(huán)節(jié)，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起主要作用。wnt蛋白與相應(yīng)受體結(jié)合將啟動該信號途徑的活性，

4、引起β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的堆積，β-catenin可以通過核孔進(jìn)入到細(xì)胞核中，作為轉(zhuǎn)錄激活因子激活下游靶基因。在絕大多數(shù)正常組織中，β-catenin僅見于細(xì)胞連接中，有研究顯示β-catenin在一些惡性腫瘤如結(jié)腸癌、卵巢癌、食管癌、肝癌等腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)。最近研究發(fā)現(xiàn)β-catenin對于毛囊的發(fā)生發(fā)育是不可缺少的因素。在胚胎期，毛囊發(fā)育過程中如果β-catenin基因發(fā)生突變，毛囊的正常形成途徑受阻。同時β-catenin參與

5、皮膚中干細(xì)胞分化途徑的選擇，為了更加清楚地了解β-catenin與毛囊之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)從四個方面應(yīng)用IHC和RT-PCR的方法分別檢測β-catenin在毛囊周期、發(fā)育、損傷修復(fù)以及細(xì)胞分化中表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示β-catenin對毛囊的生長具有重要的促進(jìn)作用，可能是毛囊生長和周期維持重要的調(diào)節(jié)因子。主要結(jié)果如下： 1.毛囊隆突區(qū)細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)體外成功地分離、培養(yǎng)出毛囊隆突區(qū)細(xì)胞，為下一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。DMEM/F12補(bǔ)充

6、培養(yǎng)基較為適宜細(xì)胞生長，在此培養(yǎng)條件下，細(xì)胞可傳至六代，并保持較強(qiáng)的增殖能力；培養(yǎng)在5-6天時細(xì)胞數(shù)量達(dá)峰值，且能維持較長的生長期。培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)均一，呈鋪路石狀，可見有絲分裂相，核漿比大，表現(xiàn)出原始細(xì)胞形態(tài)特征。細(xì)胞周期結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的毛囊隆突區(qū)細(xì)胞迅速進(jìn)入增殖狀態(tài)，而全毛囊細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞從毛囊隆突區(qū)長出，提示在整個毛囊中最具增殖潛能的細(xì)胞聚集于隆突區(qū)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示體外培養(yǎng)的隆突區(qū)細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)β1-integrin和K

7、19，而在體實(shí)驗(yàn)亦表明毛囊隆突區(qū)同樣表達(dá)β1-integrin和K19，而K10呈陰性，這說明原代培養(yǎng)毛囊隆突區(qū)細(xì)胞中含有毛囊干細(xì)胞。 2.β-catenin在毛囊中的表達(dá)及作用在測定毛囊周期的基礎(chǔ)上，分別檢測毛囊周期不同階段中β-catenin表達(dá)的變化。結(jié)果顯示大鼠毛囊周期大約為28d，其中1-18d為生長期，19-22d為退化期，23-28d為靜止期。β-catenin在生長期毛囊中呈強(qiáng)表達(dá)，而在退化期和靜止期表達(dá)微弱。通

8、過研究β-catenin在毛囊發(fā)育過程中的作用發(fā)現(xiàn)，β-catenin蛋白的表達(dá)與毛囊發(fā)育的不同階段具有相關(guān)性，特別是陽性細(xì)胞集中于成熟毛囊外根鞘內(nèi)側(cè)，提示β-catenin可能參與毛囊細(xì)胞的分化與成熟。建立大鼠毛囊損傷的動物模型，應(yīng)用免疫組化和RT-PCR檢測毛囊損傷前后β-catenin表達(dá)的變化規(guī)律。結(jié)果顯示損傷后毛囊外根鞘中強(qiáng)表達(dá)β-catenin，在損傷24h后達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，到72h時恢復(fù)正常水平。以上結(jié)果提示β-c

9、atenin參與毛囊周期維持、毛囊發(fā)育以及毛囊損傷修復(fù)的過程，可能是毛囊生理活動重要的調(diào)節(jié)途徑之一。 3.β-catenin在毛囊隆突區(qū)細(xì)胞生長、分化中的作用成功誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的毛囊隆突區(qū)細(xì)胞向皮脂腺分化，進(jìn)一步證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為具有多向分化潛能的干細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測毛囊隆突區(qū)細(xì)胞β-catenin和cox-2表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均與毛囊隆突區(qū)細(xì)胞增殖有關(guān)，cox-2可能是β-catenin作用途徑的核內(nèi)靶基因。本實(shí)驗(yàn)初步探討了β

10、-catenin促增殖的作用機(jī)理，認(rèn)為胞內(nèi)堆積的β-catenin進(jìn)入核內(nèi)后，通過激活cox-2活性發(fā)揮作用。此外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示β-catenin在誘導(dǎo)后細(xì)胞中表達(dá)明顯降低，說明其可能參與毛囊干細(xì)胞分化途徑的選擇。 本實(shí)驗(yàn)首先建立了毛囊隆突區(qū)細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法，結(jié)合隆突區(qū)細(xì)胞增殖能力、形態(tài)學(xué)特征、標(biāo)記物表達(dá)以及分化潛能，認(rèn)為原代培養(yǎng)毛囊隆突區(qū)細(xì)胞含有毛囊干細(xì)胞，同時探討了β-catenin在毛囊生長、發(fā)育和周期維持中的重要作用，