β-catenin基因轉(zhuǎn)染對人毛囊干細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、研究背景和目的： 嚴(yán)重皮膚缺損如嚴(yán)重大面積燒傷創(chuàng)面的修復(fù)仍是目前臨床工作的重點和難點。以皮膚干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化皮膚是新的發(fā)展方向。研究表明，毛囊干細(xì)胞具有高增殖和多向分化的潛能，在維持機(jī)體的自穩(wěn)及皮膚組織的自我更新中具有重要作用，有望成為皮膚修復(fù)和組織工程皮膚種子細(xì)胞的重要來源之一。因此，毛囊干細(xì)胞吸引了眾多在創(chuàng)傷修復(fù)及組織工程領(lǐng)域?qū)W者的研究興趣。 干細(xì)胞的顯著特點是慢增殖周期，而作為種子細(xì)胞需要一定的數(shù)量和

2、增殖速度。毛囊干細(xì)胞是近年來創(chuàng)傷修復(fù)和組織工程領(lǐng)域的研究熱點，同時也取得了一定的研究進(jìn)展。但是，迄今為止距離將其作為大量提供給組織工程化皮膚的來源、或常規(guī)的用于臨床治療的來源仍有很大的困難，其主要原因是對毛囊干細(xì)胞的認(rèn)識仍不夠完善，尤其是對如何調(diào)控和誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制尚不明確，缺乏有效地培養(yǎng)及誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞增殖的措施及手段。因此，探討調(diào)控毛囊干細(xì)胞增殖的信號途徑及分子機(jī)制，找尋一種促進(jìn)毛囊干細(xì)胞體外大量增殖的有效途徑，無疑將

3、為進(jìn)一步誘導(dǎo)其定向分化并最終推動創(chuàng)傷修復(fù)及組織工程化皮膚研究的發(fā)展具有重要的理論意義。許多研究證明，Wnt/β-catenin信號通路是一條控制細(xì)胞命運(yùn)及組織 器官形態(tài)發(fā)生的重要通路。Β-catenin不僅具有介導(dǎo)細(xì)胞粘附的能力，而且是Wnt/β-catenin信號通路中調(diào)控干細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵分子。而目前關(guān)于β-catenin對人毛囊干細(xì)胞增殖影響的研究國內(nèi)外鮮有報道，如果能夠通過干預(yù)毛囊干細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)促進(jìn)其

4、增殖，無疑將為構(gòu)建組織工程皮膚提供充足的種子細(xì)胞。本研究通過構(gòu)建β-catenin慢病毒載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞，觀察其對毛囊干細(xì)胞增殖的影響，以期為進(jìn)一步誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞定向分化和構(gòu)建組織工程皮膚奠定重要理論基礎(chǔ)。 研究方法： 1、通過中性蛋白酶-胰蛋白酶消化法分離人毛囊干細(xì)胞，結(jié)合低鈣角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；通過免疫熒光染色法檢測CD200、K19、β-integrin、LEF1表達(dá)情況以鑒定人毛囊干細(xì)胞并觀察隨培

5、養(yǎng)時間延長其表面標(biāo)志物變化；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁、增殖的形態(tài)學(xué)特征；選用MTT法和羅丹明B-硫酸尼羅藍(lán)染色法分別檢測人毛囊干細(xì)胞的增殖特性及克隆形成能力；用β-半乳糖苷酶染色法檢測人毛囊干細(xì)胞衰老程度。 2、提取人血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法，以自行設(shè)計的帶有酶切位點的引物，擴(kuò)增獲得β-catenin基因全部序列，構(gòu)建T-A克隆，酶切此亞克隆到pGC-FU-EGFP載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，篩選

6、陽性克隆，PCR及測序鑒定正確后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染FT293細(xì)胞，Western-blot檢測β-catenin-EGFP融合蛋白表達(dá)，然后進(jìn)行包裝，得到含有β-catenin-EGFP融合基因的慢病毒，通過Real-time定量PCR法測定病毒滴度。 3、設(shè)立陰性對照組、空病毒對照組和病毒組，將β-catenin慢病毒感染毛囊干細(xì)胞；MTT法檢測感染前后毛囊干細(xì)胞的增殖活性；羅丹明B和硫酸尼羅藍(lán)染色法檢測感染前后毛囊干細(xì)胞克隆形

7、成能力；免疫熒光染色法檢測感染后毛囊干細(xì)胞β1-integrin表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 1、中性蛋白酶-胰蛋白酶消化法可獲取數(shù)目多，活力高的毛囊隆突部細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)，共可傳10代。經(jīng)免疫熒光檢測各代細(xì)胞均表達(dá)CD200、K19、β-integrin，而基本不表達(dá)LEF1。MTT結(jié)果顯示：毛囊干細(xì)胞4～20天增殖最為活躍，3周后增殖能力開始下降。早期毛囊干細(xì)胞呈明顯克隆性生長，細(xì)胞克隆形成能力明顯高于角質(zhì)細(xì)胞對照組（1

8、59.67±12.75 vs 44.67±6.25，P＜0.01）。第5代毛囊干細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯高出對照組（第2代）細(xì)胞（70.10％±5.78％vs 0.17％±0.05％，P＜0.01），到第8代近100％細(xì)胞陽性。 2、PCR及測序鑒定證實目的基因正確克隆至慢病毒質(zhì)粒中，目的基因序列與GENEBANK報道一致，熒光顯微鏡可觀察到GFP的表達(dá)，Western-blot證實β-catenin-EGFP融合

9、蛋白在FT293細(xì)胞中表達(dá)，經(jīng)測定，病毒滴度為2.0×108TU/mL。 3、在感染復(fù)數(shù)（MOI）為10時，β-catenin慢病毒轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞后48h，感染效率可達(dá)到80％左右，且感染后3w效率仍可達(dá)80％-90％；從第3d開始，感染組各個時相點較對照組毛囊干細(xì)胞增殖能力均有顯著差異（P＜0.05）；β-catenin慢病毒感染毛囊干細(xì)胞10d，細(xì)胞克隆形成明顯高于對照組[（85.22±2.54）vs（69.86±1.21

10、）/（68.00±2.00）（P＜0.05）]，而且病毒組細(xì)胞克隆明顯大于空病毒組和陰性對照組；免疫熒光檢測結(jié)果提示β-catenin慢病毒感染毛囊干細(xì)胞后3w，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，其β1-integrin表達(dá)較對照組明顯減低，提示毛囊干細(xì)胞有分化趨勢。 研究結(jié)論： 1、中性蛋白酶-胰蛋白酶消化法結(jié)合低鈣K-SFM培養(yǎng)，方法簡便，效率高,能夠獲取高質(zhì)量的毛囊干細(xì)胞，可用于進(jìn)一步基因干預(yù)實驗研究；毛囊干細(xì)胞的增殖克隆能力