毛囊干細胞向上皮細胞分化及其相關調(diào)控信號的初步研究.pdf

1、第一部分 小鼠鼠須及人頭皮毛囊干細胞的定位及特點 目的：明確小鼠鼠須墊毛囊及成年男性額部毛囊干細胞的定位及分布特點，篩選鼠須墊切片快速高效的方法，比較正常成年男性與脂溢性脫發(fā)成年男性額部毛囊干細胞數(shù)量差別。 方法：取8周齡BALB/C小鼠雙側(cè)鼠須墊，自制標本固定器脫水，包埋切片，作常規(guī)HE染色及角蛋白15(CK15)免疫組化；取正常成年男性及脂溢性脫發(fā)成年男性額部頭皮，脫水包埋切片，并作常規(guī)HE染色及角蛋白15免疫組化，

2、顯微鏡下分析結(jié)果并比較。 結(jié)果：在顯微鏡下：①HE染色及CK15免疫組化能明確顯示小鼠(BALB/C)鼠須墊毛囊毛囊外根鞘(ORS)、內(nèi)跟鞘(IRS)、毛乳頭(FP)及毛干(HS)及立毛肌等結(jié)構(gòu)。在毛囊立毛肌止點外根鞘隆起的部位小范圍角蛋白CK15表達明顯。②HE染色及CK15免疫組化能明確顯示成年男性額部頭皮毛囊外根鞘、內(nèi)跟鞘、毛乳頭、皮脂腺、毛干及立毛肌等結(jié)構(gòu)。但與小鼠不同，成年男性額部頭皮毛囊CK15表達自皮脂腺開口水平以

3、下的外根鞘狹長區(qū)域延展至中部，逐漸變淡。額部毛囊干細胞數(shù)量正常成年男性高于脂溢性脫發(fā)成年男性(P<0.05)。 結(jié)論：小鼠鼠須毛囊干細胞位于毛囊立毛肌止點附近的隆突內(nèi)，人頭皮毛囊干細胞位于毛囊皮脂腺開口水平以下狹長區(qū)域的外根鞘內(nèi)，并且額部毛囊干細胞數(shù)量正常成年男性高于脂溢性脫發(fā)成年男性。 第二部分 小鼠鼠須毛囊干細胞向短暫增殖細胞(TA細胞)分化的研究 目的：研究小鼠鼠須毛囊干細胞在外源性表皮生長因子(EGF)及

4、創(chuàng)傷的誘導下，向TA細胞分化的情況。 方法：將8周齡BALB/C小鼠隨機分4組，雙側(cè)鼠須墊去表皮，每天經(jīng)口內(nèi)頰粘膜注射EGF，分別為 0IU，1000IU，5000IU，10000IU，觀察創(chuàng)面恢復情況，確定最佳干預劑量。 將 8 周齡BALB/C小鼠隨機分三組，分別記為EGF組、創(chuàng)傷組和空白組。EGF干預采用每天經(jīng)口內(nèi)頰粘膜注射法(劑量5000IU)，創(chuàng)傷采用鼠須墊去表皮法。 ①分別于DO、D1、D3、D5、D

5、7、D9(D-天)收集鼠須墊標本，脫水固定，做CK15及CK14免疫組化，CK15及CK14陽性細胞計數(shù)，方差分析不同組別不同時間有無差別。②取三組D0、D1、D3、D5、D7、D9小鼠鼠須墊，提取其毛囊真皮鞘細胞，F(xiàn)ACS分析其CK15及CK14陽性細胞比率變化。結(jié)果三種劑量EGF均加速傷口愈合，0IUEGF組創(chuàng)面愈合時間為9天，1000IUEGF組為8天，5000IUEGF及10000IU組沒有差別，均為7天。確定每天一次給予500

6、0IU EGF為后續(xù)實驗干預劑量。 免疫組化結(jié)果：①CK15陽性細胞聚集于隆突部，與第一部分實驗結(jié)果一致：a同組別不同時點比較，EGF組在不同時點CK15陽性細胞數(shù)目差別顯著。第1天比第0天明顯減少，第3天比第1天明顯減少，第5天比第3天明顯減少，第7天比第5天明顯減少，第9天比第7天明顯減少(均為P<0.05)；創(chuàng)傷組在不同時間點CK15陽性細胞數(shù)目也呈現(xiàn)類似的變化，CK15陽性細胞漸次減少(均為P<0.05)；空白組在不同時

7、間CK15陽性細胞數(shù)目無明顯變化(P>0.05)。b同時點不同組別比較，在第0天時各組CK15陽性細胞數(shù)目無顯著差別(P>0.05)，在第1天，EGF組及創(chuàng)傷組與空白組都有明顯差別(P<0.05)，但兩者之間無顯著差別(P>0.05)。第3，5，7，9天不同組別CK15陽性細胞數(shù)目差別顯著，均為第空白組最多，其次為創(chuàng)傷組，EGF組組最少(均為P<0.05)。 ②CK14陽性細胞分布范圍則明顯廣于CK15陽性細胞，毛囊外根鞘及皮下

8、組織均可見廣泛表達：a同組別不同時點比較，EGF組在不同時點CK14陽性細胞數(shù)目差別顯著。第1天比第0天明顯增多，第1到7天緩慢增多，第9天比第7天又明顯增多(均為P<0.05)；創(chuàng)傷組在不同時間CK14陽性細胞細胞數(shù)目也不同，增多速度比較平緩；空白組在不同時間CK14陽性細胞數(shù)目無明顯變化(P>0.05)。b同時點不同組別比較，在第0天時各組CK14陽性細胞數(shù)目無顯著差別(P>0.05)，第1，3，5，7，9天不同組別CK14陽性細胞

9、數(shù)目差別顯著，均為空白組最少，其次為創(chuàng)傷組，EGF組最多(均為P<0.05)。 流式細胞分析結(jié)果：分析顯示EGF組、創(chuàng)傷組CK15陽性細胞比率從第1天開始就明顯下降，且下降速率前者大于后者，空白組沒有明顯變化。EGF組、創(chuàng)傷組CK14陽性細胞比率逐漸增加，且前者大于后者，空白組沒有明顯變化。 結(jié)論： ①外源性EGF能加速小鼠創(chuàng)面的愈合，每天給予5000IU能顯著加速創(chuàng)面的愈合。 ②EGF與創(chuàng)傷均能啟動小鼠

10、鼠須毛囊干細胞向TA細胞分化。EGF能加速創(chuàng)面的愈合，這種作用在干預的前期效果明顯，隨著時間的推移，作用減弱。 第三部分 EGF干預下小鼠鼠須毛囊外根鞘Notch信號變化的研究目的研究在外源性EGF及創(chuàng)傷的刺激下，小鼠毛囊外根鞘細胞中Notch信號的相關組分變化情況及信號的活化情況。 方法：將8周齡BALB/C小鼠均分三組，分別為EGF組、創(chuàng)傷組和空白組。EGF干預采用每天間斷經(jīng)口內(nèi)頰粘膜注射法，創(chuàng)傷采用鼠須墊去表皮法。

11、分別于D0、D1、D3、D5(D-天)收集鼠須墊標本，分離毛囊外根鞘，制成單細胞懸液，抽取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR分別做Notchl、Delta、EGFR、及Notch信號的活化成分ICN基因測試，并比較各組有無差別。 結(jié)果： ①各組細胞均能檢測到Notchl、Delta、EGFR基因，且條帶半定量分析基本相同，無明顯區(qū)別(P>0.05)。 ②EGF干預組在第1天能檢測到ICN條帶，灰度較淡。第1

12、，3，5天均未測得。另外兩組標本均未能測得ICN條帶。 結(jié)論： ①在外源性EGF刺激下，小鼠鼠須毛囊外根鞘細胞Notch信號被激活，且早期明顯。提示EGF通過Notch信號途徑促進創(chuàng)面的愈合。 ②創(chuàng)傷刺激未能激活Notch信號。 第四部分 人自體毛囊移植治療慢性大面積創(chuàng)面的研究 目的：探索用自體毛囊移植治療慢性大面積創(chuàng)面的可能性。 方法：選擇慢性難治性大面積創(chuàng)面病例，患者知情同意，創(chuàng)面清創(chuàng)

13、，控制感染至新鮮肉芽組織無膿性滲液。枕后備皮，英國刀取刃厚皮，修剪成0.5cm×0.5cm郵票狀；切取取皮區(qū)毛囊，顯微鏡下單根分離約400根，形成去表皮毛囊。創(chuàng)面縱行分為兩區(qū)：毛囊種植區(qū)及刃厚植皮區(qū)。凡士林油紗布覆蓋，抗生素生理鹽水紗布包扎，患肢制動。定期換藥，觀察兩區(qū)創(chuàng)面愈合情況；取活檢，HE常規(guī)染色，免疫組化檢測CK廣譜、vimentin(彈性蛋白)表達，觀察新生皮膚情況。 結(jié)果：①大體觀察術(shù)后2周：毛囊種植區(qū)可以看到蒼白色

14、新生上皮由移植毛囊向外長出，以移植毛囊為中心成鵝卵石皮島樣分布；刃厚植皮區(qū)植皮成活，但生長較慢。術(shù)后8周：毛囊種植區(qū)新生皮膚連接成片，色澤基本一致，并有部分新生汗毛樣纖細毛發(fā)長出；刃厚植皮區(qū)瘢痕化明顯，皮膚色澤不均。術(shù)后10周：毛囊種植區(qū)新生皮膚逐漸成熟，成暗紅色，能耐受一定程度摩擦；刃厚植皮區(qū)瘢痕化明顯，凹凸不平。術(shù)后4月：毛囊種植區(qū)新生皮膚成熟，顏色質(zhì)地均勻，并有纖細汗毛樣毛發(fā)生長；刃厚植皮區(qū)則瘢痕明顯，質(zhì)地較差。 ②免疫組

15、化毛囊種植區(qū)2周始新生表皮由毛囊延伸長出，CK廣譜表達較高，并出現(xiàn)表皮與真皮間的釘突結(jié)構(gòu)(rete ridges)，刃厚植皮區(qū)也看到類似結(jié)構(gòu)。8周后，毛囊種植區(qū)新生皮膚見到大量釘突樣結(jié)構(gòu)，表皮與其下真皮樣組織結(jié)合緊密，表達大量 vimentin，未發(fā)現(xiàn)皮脂腺及汗腺結(jié)構(gòu)，刃厚植皮區(qū)也未發(fā)現(xiàn)腺體結(jié)構(gòu)。 結(jié)論： ①自體毛囊移植后表皮細胞以毛囊為中心向外長出，修復創(chuàng)面。愈合創(chuàng)面有一定耐磨擦能力。 ②對于慢性大面積難治性創(chuàng)