中期因子蛋白對體外培養(yǎng)肺腺癌A549株MMP-9表達的影響.pdf

1、分類號UDC碩士學位論文密級中期因子蛋白對體外培養(yǎng)肺腺癌A549細胞株MMP一9表達的影響EffectionofMidkineontheexpressionofMMP一9oflungadenocarcinomacelllineA549aninvitro作者姓名：徐玉潔學科專業(yè)：臨床醫(yī)學(內科學)學院(系、所)：湘雅二醫(yī)院指導教師：諸蘭艷副教授論文答辯日期!!：!蘭：習答辯委員會主席中南大學二。一二年五月碩士學位論文中文摘要摘要目的：以人

2、肺腺癌A。。。細胞株作為研究對象(以下簡稱A瑚細胞)，觀察不同濃度中期因子蛋白(MK)干預A。。。細胞株MMP一9的表達變化，探討MK與刪P一9在腫瘤侵襲轉移中是否相關，進一步探討MK促進肺癌侵襲和轉移的可能作用機制。方法：(1)MTT實驗檢測MK對A。。。細胞增殖的作用設空白對照組及2ng／mL、lOng／mL、50ng／mL和250ng／mLMK蛋白干預組，對照組僅加等量的1640培養(yǎng)液，各濃度復3孔。每隔2d更換含同樣藥物濃度的新

3、鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)l～8天，加入MTT繼續(xù)孵育4h后，用酶標儀測490nm吸光度(A)值。實驗重復3次。(2)半定量逆轉錄一聚合酶聯(lián)反應(RTPCR)檢測塒P一9mRNA的表達設對照組及2ng／mL、lOng／mL、50ng／mL和250ng／mLMK蛋白干預組。MK蛋白作用7天后收集細胞，抽提細胞總RNA，進行逆轉錄和PCR擴增。MMP一9擴增35個循環(huán)，其擴增片段長度為320bp，以GAPDH為內參照，擴增35個循環(huán)，長度450bp，實

4、驗重復3次。(3)免疫細胞化學實驗檢測姍P一9蛋白的表達取對數(shù)生長期的細胞，制成單細胞懸液后，以2500個／孔接種于24孔板上，每孔體積500ul。8h貼壁后加入含MK蛋白的1640培養(yǎng)基，使終濃度為2ng／mL、lOng／mL、50ng／mL和250ng／mL，對照組僅加等量的培養(yǎng)液。每組復3孔。干預滿7天后，加入4％多聚甲醛固定。一抗稀釋比例為1：100，4。C孵育過夜。然后按照免疫組化試劑盒規(guī)定的步驟進行，在200倍和400倍高倍

5、鏡下觀察拍照，隨機選攝5個視野／孔，用圖像分析系統(tǒng)觀察分析。結果：1MTT檢測MK對A。。。細胞促增殖的作用：用MTT法檢測不同作用時間、不同作用濃度的MK干預A。。。細胞后的促增殖作用用不同濃度MK(Ong／ml、2ng／ml、lOng／ml、50ng／ml、250ng／m1)作用于AⅢ細胞1～8d后，用MTT比色法測得的各組OD㈣nm值(A值)，并繪制生長曲線圖。不同濃度MK干預A啪細胞后其生長曲線具有相同的趨勢，各干預組自第3天起