Nrf2及其靶基因在人肺腺癌A549順鉑耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)和意義.pdf

1、研究背景:肺癌在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤之首,其發(fā)病率逐年升高,嚴(yán)重影響著人類的生命健康。由于腫瘤異質(zhì)性的存在,不同個(gè)體及腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性存在很大差異,不同肺癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性也不完全相同?；瘜W(xué)治療是肺癌綜合治療的重要手段之一,但在化學(xué)治療中卻存在對(duì)正常組織細(xì)胞損傷的毒副作用,為了提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性及治療效果,減輕化療藥物對(duì)機(jī)體的毒副反應(yīng),有必要探討不同腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性或耐藥性的分子生物學(xué)機(jī)

2、制,為今后腫瘤的個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2,Nrf2)是調(diào)節(jié)正常細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性的應(yīng)答反應(yīng),抵御外界不良應(yīng)激刺激的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,包括順鉑在內(nèi)的化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞而言是不良刺激,在這種情況下轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是否發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用,介導(dǎo)腫瘤耐藥所涉及到的具體機(jī)制值得探討。國外有研究表明Nrf2與腫瘤順鉑耐藥有關(guān),這已在卵巢癌中得以證實(shí):Cho等人阻斷Nrf2后發(fā)現(xiàn)耐順鉑的人

3、卵巢癌SK-OV細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性增加。然而Nrf2與肺腺癌順鉑耐藥相關(guān)性的研究目前國內(nèi)未見報(bào)道。該研究是初步探討Nrf2與肺腺癌順鉑耐藥的關(guān)系及可能的腫瘤耐藥機(jī)制,為今后給予相應(yīng)的干預(yù)措施逆轉(zhuǎn)肺腺癌耐藥、提高化療效果提供新的理論依據(jù)。
　　 目的:該研究旨在測定轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其靶基因在人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株(A549/DDP)及其親本細(xì)胞株(A549)中的定量表達(dá),從Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路角度研究肺腺癌順鉑耐藥的機(jī)制,從而

4、為個(gè)體化治療及從基因水平開發(fā)新的耐藥拮抗劑提供新的理論依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1.人肺腺癌A549細(xì)胞是經(jīng)手術(shù)標(biāo)本傳代培養(yǎng)獲得,人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞系(A549/DDP)是在體外經(jīng)小劑量順鉑逐漸加量誘導(dǎo)親本細(xì)胞A549獲得的,均由天津市肺癌研究所提供。兩株細(xì)胞分別用含10％小牛血清、青霉素和鏈霉素各100u/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.125％胰蛋白酶消化傳代。實(shí)

5、驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。
　　 2.用MTT法檢測A549/DDP細(xì)胞的耐藥性,求出耐藥指數(shù)。
　　 3.采用Real-time PCR法檢測目的基因的定量表達(dá):實(shí)驗(yàn)分兩組:A549細(xì)胞組、A549/DDP細(xì)胞組。取出等量(1×106)的細(xì)胞,抽提細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、Real-time PCR檢測兩組細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、其信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因Keap1及靶基因:GCL、NQO1、GSTP1、HO-1

6、、MRP1、MRP2、MRP3及MRP4的定量表達(dá),最后采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分別對(duì)兩組間各個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞形態(tài)比較:倒置顯微鏡下A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞均貼壁生長良好,A549細(xì)胞較小,類圓形不規(guī)則,A549/DDP細(xì)胞在DDP刺激下細(xì)胞形態(tài)變得較大,呈長梭形,少數(shù)為三角細(xì)胞形態(tài)。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)所用A549/DDP和A549細(xì)胞具有高度同源性,A549/DDP經(jīng)凍

7、存再復(fù)蘇后耐藥性質(zhì)穩(wěn)定。經(jīng)3次獨(dú)立重復(fù)MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:DDP藥物濃度分別與A549/DDP細(xì)胞和親本細(xì)胞生長抑制率成正相關(guān),IC50分別為(8.36±0.44)ug/ml、(0.69±0.09)ug/ml,A549/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)為親本細(xì)胞的12.12倍,屬于中度耐藥細(xì)胞。
　　 3.Realtime PCR結(jié)果提示,耐藥細(xì)胞株A549/DDP與敏感株A549相比轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)伴

8、侶分子Keap1、轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的靶基因NQO1、GSTP1、GCL、HO-1、MRP4的mRNA表達(dá)增加,MRP1、MRP2及MRP3的mRNA表達(dá)降低,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：人肺腺癌A549順鉑耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與Keap1、轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其靶基因HO-1、GCL、MRP4、GSTP1、NQO1的高表達(dá)有關(guān),這些靶基因通過各自或聯(lián)合的作用降低肺腺癌細(xì)胞凋亡、加速順鉑代謝、改變藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布使順鉑遠(yuǎn)離作用