可系統(tǒng)性給藥的蜂毒肽脂質(zhì)納米顆粒及其抗黑色素瘤作用研究.pdf

1、蜂毒肽，作為蜂毒的主要成分，是一種具有α螺旋結(jié)構(gòu)的兩親性多肽。蜂毒肽在疾病治療上有廣泛的應(yīng)用，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗輻射和降血壓等作用。蜂毒肽應(yīng)用于腫瘤治療具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能夠在質(zhì)膜上打孔造成細(xì)胞裂解死亡，從而避開(kāi)了腫瘤的耐藥性問(wèn)題。然而，蜂毒肽自身存在的溶血性問(wèn)題、非特異性作用以及易被代謝降解等缺點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了其在抗腫瘤方面的臨床應(yīng)用。如何在活體內(nèi)安全有效地運(yùn)輸蜂毒肽抵達(dá)腫瘤組織而不產(chǎn)生毒副作用，仍是極具挑戰(zhàn)的難題。本文采用以

2、仿HDL多肽脂質(zhì)納米顆粒為基礎(chǔ)的運(yùn)載方法，有效地解決了蜂毒肽在活體腫瘤治療中存在的溶血問(wèn)題，并延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的循環(huán)周期，而且實(shí)現(xiàn)了在腫瘤區(qū)域特異性地釋放，主要取得了以下研究結(jié)果：
　?。?）發(fā)明了一種新型的含蜂毒肽的功能性雜化多肽α-melittin。它是由蜂毒肽與一條α螺旋結(jié)構(gòu)的載脂蛋白模擬肽（α-peptide）通過(guò)共價(jià)連接而成。α-melittin在保留了蜂毒肽的自發(fā)形成多聚體和裂解細(xì)胞等屬性的基礎(chǔ)上，具有更強(qiáng)的磷脂親和力以

3、及α螺旋結(jié)構(gòu)形成能力。與α-peptide相比，α-melittin具有更強(qiáng)大的粒徑控制力，能夠?qū)⒘字纬傻募{米顆粒粒徑控制在10nm左右甚至更小，同時(shí)具有很高的包封率（>80％）。
　?。?）利用α-melittin合成的脂質(zhì)納米顆粒α-melittin-NP，實(shí)現(xiàn)了活體內(nèi)蜂毒肽的安全有效遞送。α-melittin-NPs是一種粒徑在14nm左右，分散性良好的球形納米顆粒，其核心可以同時(shí)運(yùn)載疏水性分子。α-melittin-NP

4、s性質(zhì)穩(wěn)定，在血清和血漿等生理溶液中仍然保持穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)。憑借蜂毒肽與α-peptide羧基端疏水性氨基酸的連接設(shè)計(jì)以及α-melittin與磷脂層的強(qiáng)力結(jié)合，α-melittin-NPs有效地隱藏了蜂毒肽的陽(yáng)離子電荷（21.33±1.64mV），表現(xiàn)為近中性納米顆粒（2.45±0.56mV）。α-melittin-NPs明顯降低了蜂毒肽的溶血性和非特異性破壞作用。體外溶血實(shí)驗(yàn)表明，α-melittin-NPs對(duì)血細(xì)胞的裂解作用顯著降

5、低，即使在50μM的高濃度下也只有8%左右的溶血率。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，α-melittin-NPs對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的IC50值（11.26±1.37μM）較蜂毒肽（1.71±0.04μM）有顯著的提升。激光共聚焦連續(xù)成像的結(jié)果表明，α-melittin-NPs與黑色素瘤細(xì)胞接觸后造成細(xì)胞膜通透性改變，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)容物泄漏、細(xì)胞核分解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Annexin V-FITC/PI的雙色標(biāo)記和流式分析結(jié)果表明，α-melittin-NP

6、s導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的主要途徑是發(fā)生壞死，也能誘導(dǎo)少量細(xì)胞發(fā)生凋亡。最后，α-melittin-NPs通過(guò)尾靜脈注射至皮下荷瘤鼠體內(nèi)。經(jīng)過(guò)4次給藥治療，黑色素瘤的生長(zhǎng)得到了明顯抑制，與對(duì)照組相比其抑制率高達(dá)82.8%。與此同時(shí)，通過(guò)對(duì)治療小鼠血液的生理生化指標(biāo)的檢測(cè)，以及對(duì)臟器的病理切片分析，并未顯示α-melittin-NPs對(duì)機(jī)體產(chǎn)生明顯的毒副作用。
　?。?）研制同步運(yùn)輸紫杉醇和蜂毒肽的超小納米顆粒(PTX-OL)α-meli

7、ttin-NPs，具有協(xié)同抗黑色素瘤的作用。利用激光共聚焦顯微鏡觀察到α-melittin-NPs在與腫瘤細(xì)胞相互作用時(shí)，會(huì)將蜂毒肽釋放至包括質(zhì)膜在內(nèi)的膜系統(tǒng)上，而核心內(nèi)的染料分子則被直接釋放至胞漿中。(PTX-OL)α-melittin-NPs在兩個(gè)治療機(jī)制上充分發(fā)揮了紫杉醇和蜂毒肽的抗腫瘤功能。腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，(PTX-OL)α-melittin-NPs對(duì)黑色素瘤殺傷效率明顯增強(qiáng)，IC50值是α-melittin-NPs

8、的44.8%。Annexin V-FITC/PI雙色標(biāo)記和流式分析結(jié)果表明，相比于α-melittin-NPs，(PTX-OL)α-melittin-NPs能夠誘導(dǎo)更多細(xì)胞發(fā)生壞死，提升幅度為10-20%。而且，在活體黑色素瘤治療上，(PTX-OL)α-melittin-NPs同樣展現(xiàn)出增強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果。
　　綜上所述，本研究利用仿HDL多肽脂質(zhì)納米顆粒作為蜂毒肽的運(yùn)載體，通過(guò)將蜂毒肽隱藏在單層磷脂分子層內(nèi)，有效地解決了其在