人參皂苷Rg3抗黑色素瘤作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　黑色素瘤是全世界皮膚腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因(80％)。它是一種惡性程度較高，臨床預(yù)后較差的惡性腫瘤。Ⅳ期黑色素瘤患者的中位生存時間少于1年，而5年生存期少于10％。黑色素瘤的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年增加，它的致死率的增長速度高于其他任何形式的惡性腫瘤。傳統(tǒng)的晚期轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤的治療包括:化療（達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺）、生物治療（干擾素α-2b）及藥物靶向治療（vemurafenib和ipilimumab）等。由于這些治

2、療的腫瘤反應(yīng)率低，腫瘤耐藥的產(chǎn)生及嚴(yán)重的毒副作用而限制了它們的應(yīng)用。因此，對于黑色素瘤的治療仍然需要尋找新的治療策略，新的靶點(diǎn)及新的治療藥物。
　　人參是一個古老的中草藥，它具有滋補(bǔ)、強(qiáng)心、抗炎、抗腫瘤和免疫刺激的作用。20(R)-人參皂苷Rg3是從人參中提取的單體成分，具有廣泛的藥理學(xué)活性和治療作用。報(bào)道顯示Rg3在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌及肝癌中具有抑制腫瘤生長的作用;Rg3在前列腺癌和結(jié)腸癌中具有增加多西他賽和順鉑化療敏感性的作

3、用;Rg3在肝癌細(xì)胞中具有抗腫瘤血管形成和誘導(dǎo)凋亡的作用。目前，參一膠囊（其主要成分為Rg3）已經(jīng)在中國被批準(zhǔn)為治療臨床晚期非小細(xì)胞肺癌的輔助藥物。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后的修飾與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中乙酰化和糖基化也成為抗惡性黑色素瘤的研究熱點(diǎn)。然而Rg3抗黑色素瘤的作用機(jī)制是否與調(diào)控蛋白質(zhì)的乙?；吞腔壳斑€不清楚。
　　乙酰化和去乙?；钦{(diào)控基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)過程。異常的去乙?；?HDACs)的表達(dá)與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切

4、相關(guān)。例如，HDAC6在人類乳腺癌和前列腺癌中過表達(dá)，HDAC2在宮頸癌和胃癌中過表達(dá)，HDAC8在兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤中過表達(dá)。HDAC3的過表達(dá)也在許多惡性腫瘤中被報(bào)導(dǎo)，如肺癌、結(jié)腸癌、胃癌和前列腺癌。有研究認(rèn)為HDAC3的表達(dá)與p53的乙?；c腫瘤的生長有關(guān)。然而Rg3抗惡性黑色素瘤生長的機(jī)制是否與調(diào)節(jié)HDAC3和p53乙?；谋磉_(dá)需要進(jìn)一步探索。
　　蛋白的糖基化在腫瘤病理生理過程中發(fā)揮重要的作用，包括腫瘤增殖、侵襲、血源性轉(zhuǎn)

5、移和血管形成。巖藻糖基化是蛋白糖基化的一種重要形式。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUTs)是催化合成巖藻糖的關(guān)鍵酶。其中FUT4是FUTs家族的成員之一，是催化合成α1，3-巖藻糖LeY的關(guān)鍵酶。文獻(xiàn)報(bào)道顯示FUT4在很多腫瘤中過表達(dá)，例如在結(jié)腸癌、胃癌和肺癌中。過表達(dá)FUT4能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和抗凋亡。然而Rg3在惡性黑色素瘤生長誘導(dǎo)凋亡中的作用與潛在的調(diào)節(jié)FUT4表達(dá)與EGFR/MAPK和NF-κB信號通路目前仍不清楚。
　　本研究

6、通過Rg3對HDAC3和FUT4表達(dá)調(diào)控的研究，分析Rg3在黑色素瘤中抑制腫瘤生長誘導(dǎo)凋亡及其調(diào)控的相關(guān)信號通路，進(jìn)一步探討Rg3介導(dǎo)的抗黑色素瘤作用的分子機(jī)制，以期為臨床治療黑色素瘤提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1、收集2003至2010年在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科存檔的石蠟組織標(biāo)本且臨床資料完整的惡性黑色素瘤患者32例。采用免疫組化法測定所有病理標(biāo)本中HDAC3的表達(dá)情況，并對所有病例進(jìn)行隨訪。分析HDAC3與患

7、者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。表達(dá)的組間差異比較采用x2檢驗(yàn);
　　2、利用CCK-8、MTT法及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)分析黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力;
　　3、利用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將HDAC3 siRNA、FUT4 siRNA轉(zhuǎn)染至人黑色素瘤細(xì)胞中，下調(diào)HDAC3和FUT4的表達(dá);
　　4、采用Real-time PCR的方法檢測HDAC3、PCNA、FU

8、T4和p65基因的表達(dá);
　　5、采用Western blot的方法檢測HDAC3、FUT4、LeY、Caspase-3、-8、-9、Bcl-2、Bax、Survivn、NF-κB和EGFR/MAPK信號通路等相關(guān)蛋白的表達(dá);
　　6、利用免疫組化和免疫熒光檢測HDAC3、FUT4、PCNA和p65的表達(dá);
　　7、采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡;
　　8、采用凝膠電泳遷移率(EMSA)方法檢測NF-κB與

9、DNA的結(jié)合情況;
　　9、使用熒光素酶報(bào)告基因檢測p53和NF-κB的活性情況;
　　10、使用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法檢測NF-κB與FUT4啟動子區(qū)的結(jié)合情況。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬┤藚⒃碥誖g3抑制黑色素瘤的增殖與下調(diào)HDAC3，增加p53乙?；南嚓P(guān)性研究
　　1、HDAC3過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期有關(guān);
　　2、Rg3抑制黑色素瘤的生長;
　　3、Rg3降低HDAC3的

10、表達(dá);
　　4、下調(diào)HDAC3表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖;
　　5、Rg3和下調(diào)HDAC3的表達(dá)增加p53的乙?；娃D(zhuǎn)錄活性;
　　6、Rg3下調(diào)HDAC3改變細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá);
　　7、Rg3在體內(nèi)抑制裸鼠腫瘤的生長。
　　（二）人參皂苷Rg3抑制黑色素瘤增殖與下調(diào)FUT4/LeY介導(dǎo)的EGFR/MAPK通路的失活的相關(guān)性研究
　　1、Rg3抑制A375黑色素瘤細(xì)胞的生長;
　　2、Rg3降低F

11、UT4和LeY的表達(dá);
　　3、下調(diào)FUT4的表達(dá)抑制A375細(xì)胞的增殖和減少LeY的表達(dá);
　　4、下調(diào)FUT4的表達(dá)減少EGFR/MAPK通路的磷酸化;
　　5、Rg3在體內(nèi)抑制裸鼠腫瘤的生長。
　?。ㄈ┤藚⒃碥誖g3誘導(dǎo)黑色素瘤凋亡與抑制FUT4表達(dá)通過靶向調(diào)節(jié)NF-κ B/p65信號通路機(jī)制的研究
　　1、Rg3抑制人黑色素瘤細(xì)胞的增殖;
　　2、Rg3誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡;
　　3

12、、Rg3抑制NF-κB信號通路的活性;
　　4、Rg3下調(diào)FUT4的表達(dá)抑制NF-κB連接到FUT4啟動子區(qū);
　　5、Rg3誘導(dǎo)凋亡通過抑制NF-κB信號通路及FUT4的下調(diào);
　　6、Rg3抑制黑色素瘤裸鼠腫瘤生長誘導(dǎo)凋亡。
　　結(jié)論:
　?。ㄒ唬┤藚⒃碥誖g3抑制黑色素瘤的增殖與下調(diào)HDAC3，增加p53乙?；南嚓P(guān)性研究
　　1、Rg3具有抑制黑色素瘤裸鼠動物模型和黑色素瘤細(xì)胞生長的作用;

13、r>　　2、Rg3下調(diào)HDAC3表達(dá)具有劑量和時間的依賴性;
　　3、使用siRNA或HDAC3潛在的抑制劑(MS-275)，下調(diào)HDAC3表達(dá)抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖;
　　4、Rg3抑制黑色素瘤增殖通過抑制HDAC3的表達(dá)增加p53的乙?；娃D(zhuǎn)錄活性。
　?。ǘ┤藚⒃碥誖g3抑制黑色素瘤增殖與下調(diào)FUT4/LeY介導(dǎo)的EGFR/MAPK通路失活的相關(guān)性研究
　　1、Rg3抑制黑色素瘤的生長與下調(diào)FUT4/Le

14、Y有關(guān);
　　2、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT4與調(diào)控的糖抗原LeY表達(dá)有關(guān);
　　3、Rg3抑制黑色素瘤增殖通過抑制FUT4/LeY表達(dá)及其下游的EGFR/MAPK信號通路。
　?。ㄈ┤藚⒃碥誖g3誘導(dǎo)黑色素瘤凋亡與抑制FUT4表達(dá)通過靶向調(diào)節(jié)NF-κB/p65信號通路機(jī)制的研究
　　1、Rg3具有抑制黑色素瘤裸鼠動物模型和黑色素瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)凋亡的作用;
　　2、Rg3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通過下調(diào)NF-κB信號通路