豬流行性腹瀉流行毒株部分基因分子特征及防治措施研究.pdf

1、自2010年10月起，豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)在中國(guó)嚴(yán)重暴發(fā)流行。為了解該病暴發(fā)的原因，對(duì)2010～2012年12株豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)華中地區(qū)流行毒株S基因進(jìn)行克隆、測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析。利用原核表達(dá)的PEDV河南流行毒株N基因蛋白建立了用于檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法，為豬群PED疫情防控提供工具。另外，為控

2、制此次PED疫情，研究制備PE D卵黃抗體并應(yīng)用于臨床，取得較好防控效果。
　　1.2010～2012年華中地區(qū)豬流行性腹瀉病毒分子特征和遺傳進(jìn)化分析
　　自2010年底開(kāi)始，PED在中國(guó)境內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重暴發(fā)。為探討該病突然再次暴發(fā)的原因，對(duì)2010年10月至2012年6月收集于華中地區(qū)11個(gè)地市的12株P(guān)EDV流行毒株S基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序，并對(duì)其序列變化、遺傳進(jìn)化關(guān)系、抗原位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和多肽極性進(jìn)行分析。

3、結(jié)果顯示，12株P(guān)EDV流行毒株S基因部分核苷酸及氨基酸的改變使其關(guān)鍵序列明顯不同于以往毒株，其中有11株流行毒株的S基因比現(xiàn)用疫苗毒株CV777多9個(gè)核苷酸，而且在其S1區(qū)N'端存在大量的氨基酸突變。遺傳進(jìn)化分析顯示，12株P(guān)EDV華中地區(qū)毒株與2007～2009年韓國(guó)毒株、2007～2008年泰國(guó)毒株、2009～2010年越南毒株、2011年日本毒株及2010～2012年中國(guó)其它地區(qū)流行毒株親緣關(guān)系均較密切，而與歐洲株(C V777

4、、Br(l)/87)、中國(guó)現(xiàn)用疫苗株(CV777)及2003～2007年中國(guó)分離株(LJB/03、JS-2004-2、DX、QH、LZC)親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。與現(xiàn)用疫苗株(CV777)相比，流行毒株S蛋白的抗原位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和跨膜螺旋均有明顯改變，提示PEDV在近年呈現(xiàn)快速變異和進(jìn)化的趨勢(shì)。
　　2.PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表達(dá)及ELISA方法的建立
　　用RT-PCR從腹瀉仔豬樣本中擴(kuò)增獲得了1段PEDV河南流行

5、毒株N基因全長(zhǎng)序列，根據(jù)對(duì)其氨基酸序列的抗原性分析結(jié)果，將N基因上兩個(gè)大的抗原表位區(qū)（112～321位氨基酸）克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，構(gòu)建pET-32a-N重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)中。將重組菌在37℃的條件下加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)使該蛋白獲得了高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白，分子量約41.3kD。Western-blotting分析表明，所表達(dá)的蛋白可與PED小鼠陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)。以純化的重組N蛋白作為包被抗原建立

6、了檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法，抗原最佳包被量0.226μg/孔，血清最佳稀釋度為1∶100，二抗最佳稀釋度為1∶2000，待檢血清OD450值≥0.28判定為陽(yáng)性。國(guó)內(nèi)首次用該方法對(duì)臨床豬血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)，母豬血清PED抗體陽(yáng)性率為84.26％(166/197)，仔豬血清陽(yáng)性率為27.93％(31/111)。結(jié)果表明所建立的間接ELISA方法特異性、靈敏性和可重復(fù)性良好，可用于臨床上PEDV抗體水平的監(jiān)測(cè)和PED流行病學(xué)調(diào)查

7、。
　　3.豬流行性腹瀉高免卵黃的制備及臨床應(yīng)用
　　針對(duì)病毒變異、現(xiàn)有疫苗預(yù)防效果不佳等狀況，為有效控制疫情的發(fā)生和流行，利用流行毒株制備了PED高免卵黃抗體，并對(duì)其防治效果進(jìn)行了研究。以流行毒株制備PED滅活苗免疫產(chǎn)蛋母雞，當(dāng)卵黃抗體的瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)到1∶128時(shí)收集雞蛋制備PED高免卵黃液，通過(guò)人工感染治療試驗(yàn)和臨床治療試驗(yàn)觀察其效果。人工感染治療試驗(yàn)結(jié)果表明，治療組仔豬的死亡率為10％(1/10)，而對(duì)照組死亡率高達(dá)10