豬氨基肽酶對(duì)豬流行性腹瀉病毒在細(xì)胞上增殖的影響.pdf

1、豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種以嘔吐、腹瀉、嚴(yán)重脫水為主要臨床癥狀的高度接觸性傳染病。該病是我國及世界養(yǎng)豬國家引起仔豬早期死亡的重要疫病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是Ⅰ群冠狀病毒的成員。目前對(duì)于PEDV感染機(jī)理方面的研究較少，2007年Li等證實(shí)豬氨基肽酶（porcine aminopeptidase

2、N，pAPN）為PEDV的功能性細(xì)胞感染受體。至今，還未見其它有關(guān)PEDV感染機(jī)理以及pAPN在PEDV感染過程中作用的研究報(bào)道。
　　 本項(xiàng)研究以病毒與特異性受體的作用是病毒感染繼而大量增殖的基礎(chǔ)為理論依據(jù)。首先在PEDV敏感細(xì)胞系Vero細(xì)胞中添加不同濃度的天然pAPN，并通過Vero細(xì)胞先吸附pAPN1h，不棄去pAPN吸附液，感染PEDV、先吸附pAPN1h，棄去pAPN液體，再感染PEDV和pAPN與PEDV在試管內(nèi)作

3、用1h后共同孵育Vero細(xì)胞等幾種不同作用方式，通過蝕斑計(jì)數(shù)方式，觀察pAPN對(duì)PEDV增殖的作用。結(jié)果表明，在Vero細(xì)胞中添加pAPN可增加蝕斑數(shù)，促進(jìn)病毒增殖，其中添加5μg/mlpAPN蝕斑數(shù)最多，與病毒對(duì)照孔比較差異極顯著，隨著pAPN濃度的降低，蝕斑數(shù)逐漸減少，直到pAPN為0.1μg/ml時(shí)，與病毒對(duì)照比較差異不顯著。并發(fā)現(xiàn)只有在pAPN先吸附于Vero細(xì)胞再接種PEDV，且將pAPN一直留在病毒感染體系中，這種添加方式能

4、夠最好的發(fā)揮pAPN對(duì)PEDV增殖的促進(jìn)作用；將PEDV與pAPN在體外感作后吸附細(xì)胞，產(chǎn)生的蝕斑數(shù)少于病毒對(duì)照孔。
　　 用天然pAPN制備了抗pAPN多克隆抗體，利用該多抗，通過間接免疫熒光法檢測ST細(xì)胞及Vero細(xì)胞表面氨基肽酶的存在情況。結(jié)果顯示ST細(xì)胞和Vero細(xì)胞均發(fā)出黃綠色熒光，但Vero細(xì)胞熒光亮度比ST細(xì)胞弱。說明兩種細(xì)胞均含有氨基肽酶，但Vero細(xì)胞中氨基肽酶的含量少于ST細(xì)胞。為進(jìn)一步確定：PEDV與pAP

5、N結(jié)合的特異性，研究了抗pAPN抗體對(duì)PEDV增殖的影響以及對(duì)pAPN功能的影響。蝕斑減數(shù)試驗(yàn)結(jié)果顯示抗pAPN抗體可以抑制PEDV在Vero細(xì)胞上的增殖，且可以抑制游離pAPN對(duì)PEDV增殖的促進(jìn)作用，間接證明了病毒與受體結(jié)合的特異性。
　　 為進(jìn)一步探究pAPN的功能，研究了pAPN對(duì)PEDV吸附、侵入細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，添加pAPN后，蝕斑數(shù)明顯增加，病毒的侵入率由66.1％提高至82.2％，說明pAPN參與病毒的侵入過

6、程，且對(duì)其有促進(jìn)作用。添加pAPN試驗(yàn)組的吸附率比對(duì)照組吸附率約下降18％。目前，對(duì)PEDV的理化特性方面的研究較少，不能確定4℃是否僅能吸附不能侵入，本研究借鑒其它病毒的研究方法，探索PEDV的感染機(jī)理，雖不能確定pAPN在病毒吸附過程中的作用，但對(duì)進(jìn)一步研究PEDV感染機(jī)制及pAPN功能等都有較高的參考價(jià)值。
　　 為研究pAPN蛋白上與PEDV特異性結(jié)合的受體功能域，將pAPN基因截短獲得目的基因J-P1、JP2，利用大腸

7、桿菌表達(dá)系統(tǒng)pET32a（+）（E.coliRosetta），分別表達(dá)了JP1、JP2蛋白，用純化后蛋白免疫小鼠制備相應(yīng)的多克隆抗體。用ST細(xì)胞，經(jīng)IFA鑒定JP1、JP2兩蛋白的反應(yīng)原性，結(jié)果顯示抗JP1、JP2抗體均能與ST細(xì)胞表面的pAPN反應(yīng)。通過蝕斑減數(shù)法研究抗JP1、JP2抗體對(duì)PEDV增殖的影響，結(jié)果顯示，抗JP2抗體不能抑制PEDV在Veto細(xì)胞上的增殖；抗JP1抗體能夠抑制PEDV在Vero細(xì)胞上的增殖，但其抑制作用比