超氧化物歧化酶介導(dǎo)趨化因子受體5的功能.pdf

1、趨化因子受體5(CCR5)是有七個(gè)跨膜區(qū)的促炎作用的β趨化因子受體家族的一員。自從人們發(fā)現(xiàn) CCR5 是 HIV-1 感染機(jī)體的輔助受體，并在免疫反應(yīng)中有重要作用，就一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。CCR5 的功能包括激活和調(diào)控記憶性和效應(yīng)型T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，和幼稚型樹(shù)突細(xì)胞。而CCR5的配體----趨化因子(RANTES)，可活化并增殖T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)IL-2表達(dá)，并抑制 M 嗜向性HIV的感染。 趨化因子受體有一個(gè)共同特點(diǎn)，它們的

2、活性都可由百日咳敏感性的異源三聚體 G 蛋白介導(dǎo)，但經(jīng)典的G蛋白信號(hào)通路卻不足以解釋這類(lèi)受體的多種生物學(xué)功能。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，一是通過(guò)G蛋白信號(hào)通路激活DG和PKC，激活G蛋白并最終引起胞內(nèi)Ca<'2+>濃度升高和蛋白激酶C活化，表現(xiàn)為白細(xì)胞趨化性和炎癥反應(yīng)等多種功能；二是通過(guò)酪氨酸激酶的路徑，影響FAK、Pyk2的磷酸化，與靶細(xì)胞的撒布和遷移有關(guān)；三是通過(guò)GTPase Rho的作用，與靶細(xì)胞的極化、粘附和運(yùn)動(dòng)有關(guān)；四是發(fā)現(xiàn)還可以激活MAP激

3、酶家族，可能對(duì)細(xì)胞的增殖和基因表達(dá)有關(guān)，特別是對(duì)腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌等。通過(guò)多個(gè)信號(hào)分子的放大效應(yīng)和多分支的信號(hào)傳導(dǎo)，CCR5會(huì)特異性地調(diào)控某些基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的趨化性、增殖、分化、激活產(chǎn)生影響。 巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧 (ROS) 分子，如 O2<'->、HO<'->和NO，在宿主細(xì)胞抵御病毒、細(xì)胞和腫瘤過(guò)程中有非常重要的作用。于是，ROS開(kāi)始被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)、外的信號(hào)傳導(dǎo)分子。近來(lái)，有報(bào)道ROS與HIV的感染過(guò)程也有關(guān)聯(lián)

4、。 細(xì)胞質(zhì)中的超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD，SOD-1)可將 ROS 轉(zhuǎn)變成 O<,2> 和 H<,2>O<,2>。SOD-1 可能通過(guò)影響ROS而介導(dǎo)某些信號(hào)傳導(dǎo)途徑。曾有 SOD-1 高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)研究表明，SOD-1 活性的改變可影響炎癥過(guò)程中的免疫反應(yīng)和病理學(xué)癥狀。SOD-1表達(dá)量的上調(diào)可增加巨噬細(xì)胞的功能，以應(yīng)對(duì)炎癥中升高的ROS水平，增強(qiáng)免疫效應(yīng)。 本課題中，CCR5受RANTES激活后細(xì)胞內(nèi)的

5、變化通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法——二維電泳來(lái)分析，企圖發(fā)現(xiàn)與CCR5功能相關(guān)的未見(jiàn)報(bào)道的蛋白分子。結(jié)果，在RANTES刺激HEK．293的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白樣品中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)分子量為 15.8 kDa，等電點(diǎn)為 5.4的蛋白，而在對(duì)照細(xì)胞蛋白樣品中卻沒(méi)發(fā)現(xiàn)。通過(guò)MOLDI-TOF MS/MS，發(fā)現(xiàn)這個(gè)15.8/5.4的蛋白與Cu/Zn-SOD有很高的同源性。這個(gè)發(fā)現(xiàn)提示SOD-1可能與RANTES/CCR5的趨化和激活功能有關(guān)。工作提示二維電泳

6、方法可普遍用于研究有重要生理功能的蛋白質(zhì)的作用機(jī)理。為了進(jìn)一步說(shuō)明它們之間的關(guān)聯(lián)，實(shí)驗(yàn)中分離了健康人的 PMBC，并誘導(dǎo)成為單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞(MDM) 。RANTES刺激MDM后，細(xì)胞內(nèi)SOD-1表達(dá)水平升高，細(xì)胞功能也被激活，表現(xiàn)為T(mén)NF-α分泌增加，NO的生產(chǎn)增多，而胞內(nèi)的ROS也增多。結(jié)果顯示，RANTES 的功能不只局限為細(xì)胞的趨化性，還有激活巨噬細(xì)胞的作用，這些功能在炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中非常重要。 體內(nèi)的氧自由基

7、 (ROS) 是正常氧化代謝的副產(chǎn)品。然而，活化細(xì)胞的代謝增加，勢(shì)必產(chǎn)生更多的氧自由基。此外，如巨噬細(xì)胞這樣的吞噬細(xì)胞，在發(fā)生吞噬作用或受各種各樣的刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生并釋放ROS。正如所知，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境進(jìn)行調(diào)控，對(duì)維持細(xì)胞的正常功能非常重要。從二維電泳實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SOD-1的表達(dá)與CCR5被RANTES激活后的下游功能有關(guān)。而發(fā)現(xiàn)SOD-1與RANTES/CCR5之間的關(guān)聯(lián)是一個(gè)很有意義的話題。SOD-1是機(jī)體清除過(guò)多超氧化物以抵

8、抗氧自由基危害的關(guān)鍵酶。它的這種酶學(xué)功能有其重要的后續(xù)效應(yīng)。SOD-1能保護(hù)機(jī)體抵御自由基的毒性，對(duì)炎癥過(guò)程中的重要分子的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，局部的SOD-1濃度能決定NO的生物學(xué)活性，決定H<,2>O<,2>的產(chǎn)生，而NO和H<,2>O<,2>能傳遞作為信號(hào)分子進(jìn)行信息的傳遞。 內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞產(chǎn)生的超氧化物和NO，可以快速發(fā)生反應(yīng)，生成的過(guò)亞硝酸鹽是一種潛在的ROS。巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生超氧化物和NO，也可能因此特別容易

9、受氧化劑損傷。曾有實(shí)驗(yàn)在過(guò)表達(dá)SOD-1的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，SOD-1的高表達(dá)能減弱NO的細(xì)胞毒毒性。這表明SOD-1活性的變化可影響炎癥過(guò)程中的免疫效應(yīng)和炎癥病理癥狀。在炎癥過(guò)程中，ROS水平的變化能調(diào)控后續(xù)的效應(yīng)。較低濃度的ROS可直接或間接地介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的激活，如NF-κB，最終引導(dǎo)SOD-1等各種致炎因子產(chǎn)生，反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞中毒性濃度的ROS。此外，低濃度的ROS也是一種第二信使。但是，高濃度的ROS對(duì)宿主細(xì)胞

10、有毒，并會(huì)被細(xì)胞的抗氧化防御機(jī)制清除。SOD-1和NF-κB的作用途徑不同：SOD-1能清除高濃度的毒性ROS，增強(qiáng)致炎因子的代謝和合成；而NF-κB通路，則是通過(guò)低濃度的ROS，尤其是H<,2>O<,2>，誘導(dǎo)致炎因子生成。這兩條通路是偶聯(lián)的。誘導(dǎo)能將超氧自由基歧化生成H<,2>O<,2>的SOD-1生成，可激活NF-κB，再誘導(dǎo)各種致炎因子的生成。這些研究表明在激活的巨噬細(xì)胞中，如果抑制SOD-1的活性可減弱炎癥反應(yīng)。換句話說(shuō)：SO

11、D-1活性的抑制劑提供了一種治療RANTES/CCR5相關(guān)疾病的信息和策略。 總的說(shuō)來(lái)，本課題研究表明： 1) 通過(guò)二維電泳實(shí)驗(yàn)分析和質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn) CCR5 受 RANTES 激活后，改變了包括SOD-1 在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平； 2) 從RT-PCR 和 Western Blot 實(shí)驗(yàn)證實(shí) RANTES/CCR5 促進(jìn) SOD-1 的表達(dá)，這種促進(jìn)作用是CCR5依賴(lài)性的； 3) 加入 ERK1 抑