植物和內生菌提取物抗耐藥細菌的篩選與活性成分研究.pdf

1、近年來，細菌對各類抗菌藥物產生耐藥性發(fā)展迅速，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）、多重耐藥性結核桿菌尤其是耐萬古霉素腸球菌（VRE）的出現(xiàn)，給臨床治療造成了困難。由于現(xiàn)有藥物較難控制耐藥菌感染，研制抗耐藥菌藥物已經成為藥學領域中的研究熱點。本實驗的目的是建立植物和內生菌提取物庫，以細菌、細菌外排泵及β－內酰胺酶為靶點，篩選對耐藥菌有抗菌作用的樣本，通過活性跟蹤分離，得到活性單體或組分，為研制新的抗耐藥菌

2、藥物奠定基礎。 植物及植物內生菌的次生代謝產物是一個龐大的化合物庫，是發(fā)現(xiàn)新的抗菌物質的天然資源。本實驗的樣本庫由植物及植物內生菌的提取物組成，共300個個樣本。 以臨床分離的金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌耐藥菌株為靶點，采用Kirby-Barer紙片法及藥基法進行篩選，發(fā)現(xiàn)橙色串珠霉（M.erythraea Sh.Et Dodge）的菌絲提取物具有較強的抑菌活性，用TLC進行活性跟蹤、柱色譜分離，得到具有

3、抗菌活性的單體化合物1，根據化合物1的1H、13C NMR譜及高分辨質譜，鑒定為21,25-二甲基-24-乙基-8,15,22-三烯-3β-甾醇。檢測了化合物1對9株細菌的MIC濃度，在8-128μg/ml之間，對G+菌的抑制效果強，為殺菌作用，對G-菌的抑制效果較弱，對金黃色葡萄球菌ATCC25923及耐藥株的MIC、MBC濃度相同，說明敏感株和耐藥株存在共同靶位。用金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌耐藥菌株感染小鼠，化合物

4、1的保護率在70-100％之間，呈明顯的量-效關系?；衔?屬于甾醇類化合物，毒性低（化療指數﹥7），尚無類似結構的抗菌藥物上市，因此，可作為抗菌先導物進行結構修飾，值得進一步研究。 將抗菌藥物泵出胞外是細菌廣泛存在的耐藥機制，抑制細菌外排泵(efflux pump)，可以增加細菌胞內藥物濃度，使耐藥菌恢復對原抗菌藥物的敏感性。以小蘗堿為細菌外排泵底物，建立細菌外排泵抑制劑雙平板篩選模型，從樣本庫中篩選出白前、牡丹皮乙醇提取物及

5、橙色串珠霉菌液提取物，經活性跟蹤分離，得到化合物2、3、4三個抑制細菌外派泵的活性單體，通過波譜解析，其結構鑒定為：2,4-二羥基苯乙酮(化合物2)、5,7-二羥基-4′-羥甲基異黃酮(化合物3)、2-羥基-4-甲氧基苯乙酮(化合物4)。體外試驗表明，三種化合物均能提高耐藥菌對環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、小蘗堿的敏感性。體內抗耐藥菌感染試驗發(fā)現(xiàn)，化合物2可能存在神經毒性，化合物4可以抑制動物細胞外排泵，不是細菌外排泵專一性抑制劑，化合物3

6、能提高環(huán)丙沙星對感染小鼠的保護率。測定細菌胞內小蘗堿的相對熒光強度，表明化合物2、3、4對細菌外排泵有抑制作用。化合物3屬黃酮類化合物，安全無毒，可以作為抗菌藥物增敏劑。 很多病原菌能分泌β-內酰胺酶(β-lactamase)，將β-內酰胺類抗菌素水解失活，β-內酰胺酶抑制劑可以提高產酶菌株對β-內酰胺類抗菌素的敏感性。本實驗從銅綠假單胞菌耐藥株分離純化了一種β-內酰胺酶，按Bush-Jacoby-Medeiros分類方法，屬2

7、br酶。首次建立了β-內酰胺酶抑制劑的Starch-iodine平板篩選模型，從樣本庫中篩選到2種提取物，活性跟蹤分離，得到單體化合物5、6，經波譜解析，鑒定為酒石酸、水楊酸。另從39種化合物中篩選出2個具有很強抑制活性的化合物，其中二硫聯(lián)苯體內外試驗都能提高甲氧西林的抗菌活性。以該酶為靶點，初步對水楊酸極其類似物的抑酶活性進行構效關系分析，表明水楊酸苯環(huán)上的羥基和羧基是活性基團之一，在苯環(huán)上增加羧基取代基可以較大提高抑酶活性，增加磺酸

8、基、硝基能提高抑酶活性，苯環(huán)上的氨基降低抑酶活性。為設計新的β-內酰胺酶抑制劑奠定了基礎。 多糖廣泛存在于植物中，但植物多糖抗細菌感染方面的研究不多，本課題研究了雞屎藤、白前粗多糖的體內抗耐藥菌感染效果。用沙門氏菌感染小鼠，感染前給藥時，雞屎藤粗多糖對感染小鼠的保護率為83％，白前粗多糖為66％，保護率隨多糖樣品含糖量的增加而提高；感染時同時給藥，兩種粗多糖的保護率均下降。雞屎藤、白前粗多糖均能提高感染小鼠紅細胞C3b受體活性，

9、提高小鼠清除抗原-抗體復合物的功能，提高嗜中性白細胞的吞噬活性，提高血清中特異性抗體的滴度。因此，粗多糖對小鼠的保護作用與提高免疫功能有關。 采用GC-MS技術，分析了油茶樹、白前揮發(fā)油的化學組成。油茶樹揮發(fā)油能抑制耐藥菌的生長，殺菌曲線表明，當濃度為2×MIC時，6 h殺死金黃色葡萄球菌，24 h殺死銅綠假單胞菌?？咕钚猿煞止烙嬍欠颊链?、壬醛、萜品醇、水楊酸甲酯等化合物。白前揮發(fā)油無抑菌活性，但能明顯降低雞胚中雞傳染性支氣管