持續(xù)壓力對(duì)兔椎間盤髓核細(xì)胞線粒體及細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 原代椎間盤髓核細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)
　?、逶顾骷?xì)胞的體外分離及培養(yǎng)
　　目的:建立體外兔椎間盤脊索細(xì)胞的藻酸鹽凝膠培養(yǎng)模型,并觀察其形態(tài)及生物學(xué)特點(diǎn)。
　　方法:膠原酶消化法及不連續(xù)密度梯度離心法體外分離收集原代椎間盤脊索細(xì)胞,于1.2％低粘度藻酸鹽凝膠中進(jìn)行培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、Ⅱ型膠原免疫熒光染色進(jìn)行細(xì)胞表型初步鑒定,并分別以死活細(xì)胞染色及活細(xì)

2、胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8法)檢測(cè)細(xì)定胞在藻酸鹽凝膠中的存活情況及細(xì)胞增殖能力。
　　結(jié)果:成功分離獲得原代椎間盤脊索細(xì)胞,其可穩(wěn)表達(dá)Ⅱ型膠原。原代細(xì)胞在藻酸鹽凝膠中生長(zhǎng)良好,但增殖緩慢。
　　結(jié)論:初步了解兔椎間盤脊索細(xì)胞體外生物學(xué)特性,為椎間盤退變機(jī)制及組織工程學(xué)髓核種子細(xì)胞的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　?、嬖浌菢蛹?xì)胞的體外分離培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系的建立
　　目的:觀察非接觸共培養(yǎng)條件下脊索細(xì)胞對(duì)軟骨樣細(xì)胞增

3、殖及生物學(xué)特性的影響。方法:無(wú)菌條件下取4周齡日本大白兔胸腰段脊柱,獲取髓核組織,酶消化法及不連續(xù)密度梯度法分離純化的脊索細(xì)胞及軟骨樣細(xì)胞。取第2代軟骨樣細(xì)胞與脊索細(xì)胞按1:1的比例接種于共培養(yǎng)裝置 Transwell小室中,單層培養(yǎng)的軟骨樣細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。培養(yǎng)1,3,7和10d后倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,免疫熒光法鑒定細(xì)胞表型,CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖,RT-PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原、蛋白多糖的表達(dá)。
　　結(jié)果:成功地分離純化

4、獲取脊索細(xì)胞及軟骨樣細(xì)胞。鏡下觀察見原代脊索細(xì)胞體積較大,呈圓形或橢圓形,直徑10～15μm,胞漿內(nèi)含較多大小不等的囊泡;原代貼壁的軟骨樣細(xì)胞體積較脊索細(xì)胞小,呈短梭形,直徑4～6μm。隨著非接觸共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),軟骨樣細(xì)胞增殖明顯加快,以共培養(yǎng)7,10d明顯(P<0.05);Ⅱ型膠原、蛋白多糖的表達(dá)量也逐漸增高。
　　結(jié)論:脊索細(xì)胞能促進(jìn)髓核軟骨樣細(xì)胞的增殖,其可能在阻止椎間盤退變的發(fā)生中具有一定意義。
　　第二部分 持續(xù)

5、壓力對(duì)體外單層培養(yǎng)兔椎間盤髓核細(xì)胞線粒體及細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝的影響
　　目的:本研究的目的在于觀察線粒體途徑是否參與了壓力誘導(dǎo)的兔髓核細(xì)胞凋亡這一病理過(guò)程中。
　　方法:可控加壓裝置用于觀察持續(xù)壓力(壓力強(qiáng)度為1.0Mpa)對(duì)單層培養(yǎng)髓核細(xì)胞行壓力負(fù)荷6,12,18,24及36h后造成的生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞活力情況通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 CCK-8檢測(cè),細(xì)胞凋亡率通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,凋亡相關(guān)的

6、基因和蛋白表達(dá)分別通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)PCR和Western-blot來(lái)進(jìn)行分析。Western-blot檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的蛋白表達(dá)。細(xì)胞線粒體功能主要通過(guò)線粒體膜通透孔、活性氧及線粒體膜電位進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:該壓力強(qiáng)度在上述時(shí)間點(diǎn)內(nèi)能使細(xì)胞活力明顯降低、細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的蛋白表達(dá)減少,且能誘導(dǎo)兔椎間盤髓核細(xì)胞發(fā)生凋

7、亡改變。而且該壓力能顯著抑制髓核細(xì)胞線粒體功能,表現(xiàn)為細(xì)胞線粒體膜通透孔的開放、活性氧的過(guò)度產(chǎn)生及線粒體膜電位的降低。
　　結(jié)論:該壓力不僅能抑制髓核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成代謝,而且還誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡。且其誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡可能部分通過(guò)線粒體凋亡途徑所介導(dǎo)。線粒體途徑介導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡可能是椎間盤發(fā)生退行性改變的重要機(jī)制。
　　第三部分 持續(xù)壓力對(duì)體外藻酸鹽凝膠立體培養(yǎng)兔椎間盤髓核細(xì)胞線粒體及細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝的影響

8、　　目的:本研究通過(guò)建立兔椎間盤髓核細(xì)胞藻酸鹽凝膠立體培養(yǎng)模型,觀察壓力干預(yù)對(duì)髓核細(xì)胞線粒體功能及相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　方法:將髓核細(xì)胞置于1.2％的低粘度藻酸鹽凝膠中進(jìn)行立體培養(yǎng),再行壓力干預(yù)12,24,36,40及48 h后觀察相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。如酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體脫氫酶活性,相關(guān)的基因表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR來(lái)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:該壓力強(qiáng)度在上述時(shí)間點(diǎn)內(nèi)能降低兔椎間盤髓核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖mRNA