人椎間盤細胞外基質(zhì)蛋白的質(zhì)譜研究.pdf

1、本實驗采用了蛋白質(zhì)組學的方法，包括雙向凝膠電泳，質(zhì)譜儀鑒定，對人的正常椎間盤組織內(nèi)的細胞外基質(zhì)小分子蛋白進行了初步的研究和分析，取得了有益的結(jié)果。 第一部分預實驗牛椎間盤的細胞外基質(zhì)小分子蛋白的電泳分離及質(zhì)譜分析。 目的：通過對牛椎間盤進行蛋白萃取，電泳分離以及質(zhì)譜分析檢驗實驗設(shè)計的可行性。 方法：使用Heinegard的方法對牛椎間盤進行萃取，將萃取液上樣進行SDS．PAGE梯度電泳分離蛋白質(zhì)，將分離的蛋白質(zhì)條

2、帶進行染色切割，使用胰島素酶進行消化，使用基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜儀進行蛋白質(zhì)鑒定。 結(jié)果：結(jié)果顯示牛椎間盤萃取蛋白質(zhì)在分子量16-250Kd范圍內(nèi)能夠被很好的分離，通過質(zhì)譜鑒定可鑒定出蛋白質(zhì)種類，在所鑒定的蛋白質(zhì)中不含膠原蛋白的成分。說明這種萃取方法不會破壞膠原網(wǎng)絡(luò)。 第二部分正常人椎間盤細胞外基質(zhì)小分子蛋白的質(zhì)譜鑒定研究。 目的：通過使用預實驗所確立的方法，對正常人的椎間盤組織進行蛋白質(zhì)萃取，兩維電泳分離及質(zhì)譜

3、鑒定，來確立正常人椎間盤細胞外基質(zhì)小分子蛋白的蛋白質(zhì)譜，為今后的進一步研究奠定基礎(chǔ)。 方法：使用Heinegard的萃取方法獲得萃取液，并通過超高速離心除去萃取液中的蛋白多糖成分，通過兩維電泳分離蛋白質(zhì)，把確認的蛋白質(zhì)點切割并進行胰島素酶消化，然后使用基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜儀進行蛋白質(zhì)鑒定。 結(jié)果：雙向電泳顯示，纖維環(huán)和髓核的細胞外基質(zhì)小分子蛋白無明顯差異，纖維環(huán)和髓核中的小分子蛋白在pH3～10分子量16kd～250k

4、d．范圍內(nèi)能被很好地分離，對各蛋白質(zhì)點行質(zhì)譜儀鑒定，分別確定了其中相同的19種蛋白質(zhì)。 結(jié)論：雙向電泳可有效地分離椎間盤組織中細胞外基質(zhì)小分子蛋白，通過質(zhì)譜儀鑒定可以確定其組成成分，為進一步研究椎間盤軟骨細胞外基質(zhì)小分子蛋白的功能及在椎間盤病變中的改變和所起的作用打下基礎(chǔ)。 第三部分退變椎間盤和正常椎間盤組織的細胞外小分子蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果的對比研究。 目的：通過對退變的椎間盤組織的細胞外小分子蛋白進行兩維電泳分離

5、和質(zhì)譜鑒定，和正常的人椎間盤組織細胞外小分子蛋白質(zhì)譜進行對比，以圖發(fā)現(xiàn)不同。 方法：使用罹患椎間盤突出癥患者手術(shù)中取出的椎間盤組織進行蛋白萃取，超高速離心取出蛋白多糖，兩維電泳分離，質(zhì)譜儀鑒定。 結(jié)果：在完全相同的條件下對退變的椎間盤組織進行實驗的結(jié)果顯示出了非常明顯的不同之處，既在兩維電泳凝膠上退變的椎間盤組織蛋白質(zhì)COMP的明顯缺失，經(jīng)過大量重復實驗驗證了不同之處的可重復性和穩(wěn)定性，確定了下一步的研究對象。

6、第四部分針對COMP及其裂解片斷的研究。 目的：通過以往的實驗中我們確立了以COMP為研究對象的研究方向。而某種蛋白的缺失主要是因為它本身發(fā)上了裂解而造成的，在以往對于關(guān)節(jié)軟骨的研究中發(fā)現(xiàn)，COMP的裂解位點一般是恒定的，故這部分實驗的目的是尋找該蛋白的裂解片斷，確定其裂解位點，為制備其特異性的抗體做準備。 方法：WesternBlot，硝酸銀染色及EUSA等方法。 結(jié)果：這部分實驗的進行尚未得出可靠的結(jié)果，但本