葛根素對人胚肺成纖維細胞增殖及細胞外基質合成的影響　

1、<p>　　葛根素對人胚肺成纖維細胞增殖及細胞外基質合成的影響　</p><p>　　作者：解克芳　王繼峰　牛建昭</p><p>　　【摘要】 ：目的 觀察葛根素對體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞增生和凋亡以及細胞外基質形成的影響。方法 用0～400 μg/mL濃度的葛根素作用于體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞,24～96 h后觀察不同濃度的葛根素對成纖維細胞增殖活性及其功能的影響。MTT

2、法觀察成纖維細胞的生長活性,天狼猩紅染色觀察膠原生成情況。流式細胞儀測定細胞周期時相變化。結果 80～400 μg/mL濃度作用下24～72 h范圍內,葛根素可劑量和時間依賴性地抑制人胚肺成纖維細胞的增生(P&lt;0.05)。流式細胞儀檢測結果發(fā)現,隨著濃度的增大,G0/G1期細胞百分比逐漸上升,S期細胞百分比逐漸下降,說明細胞阻滯于G0/G1期。結論 葛根素可在一定程度上抑制人胚肺成纖維細胞的增生,并誘導其凋亡,降低膠原的合

3、成,作用呈時間和劑量依賴性。 </p><p>　　【關鍵詞】 葛根素　人胚肺成纖維細胞　細胞外基質</p><p>　　Abstract：Objective To investigate the effect of puerarin on proliferation of human embro fibroblast and extracelluar matrix. Method Hu

4、man embro fibroblasts were incubated with 0～400 μg/mL puerarin for 24～96 h. The MTT method was used to assay the biological activities and extracelluar matrix formation in different time and different dose of pueratin. T

5、he cell cycle distribution was detected by flow cytometric analysis. Result Incubation cells in presence of puerarin of 40～400 μg/mL for 24～72 h c</p><p>　　Key words：puerarin；human embro fibroblast；extracell

6、uar matrix</p><p>　　肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質(ECM)聚集為特征的病變。肺成纖維細胞的過度增生和分泌膠原在肺纖維化形成過程中扮演了重要的角色。因此,尋找有效藥物抑制肺成纖維細胞的過渡增生是防治肺纖維化的重要手段之一。本實驗觀察了葛根素對人胚肺成纖維細胞增殖及ECM的影響?，F報道如下。</p><p><b>　　1 材料與方法</b

7、></p><p>　　1.1 主要試劑及儀器</p><p>　　人胚肺成纖維細胞MRC-5,中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞中心；MEM/NEAA培養(yǎng)液,中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院；胰酶,美國Sigma公司產品；葛根素標準品(分析純,含量&gt;99%),中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清,Gibco公司產品；噻唑藍(MTT),北京科海軍舟有限公司；0.1%天狼猩紅苦味酸染

8、液,北京海德生物公司。生化培養(yǎng)箱，SANYO公司；酶標儀、流式細胞儀,均為美國B.D公司產品。</p><p>　　1.2 葛根素溶液的配制</p><p>　　以少量二甲基亞砜(DMSO)溶解后,加入MEM/NEAA配制成400 μg/mL貯存液,-20 ℃閉光保存,2周內有效。使用時用DMEM/NEAA培養(yǎng)液稀釋至所需濃度(DMSO終濃度小于1‰,在本實驗條件下1‰DMSO對培養(yǎng)人胚

9、肺成纖維細胞MRC-5無明顯影響)。</p><p>　　1.3 細胞的培養(yǎng)</p><p>　　MRC-5細胞生長于含10%FBS、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM/NEAA培養(yǎng)液中,于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng),24 h后進入對數生長期,96 h長滿瓶底,3～4 d更換1次培養(yǎng)液。</p><p>　　1.4

10、 葛根素對MRC-5增生的影響</p><p>　　采用MTT法檢測。取對數生長期的MRC-5細胞胰酶37 ℃消化5 min,以10%胎牛血清的MEM/NEAA培養(yǎng)液制備成1×105/mL細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)液板中,每孔200 μL,置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),至細胞長至單層后,分別在細胞中加入不同濃度的葛根素,同時設不加藥的陰性對照和只加培養(yǎng)液的空白對照,每組設4個復孔

11、。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后,每孔加入20 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清,加入200 μL DMSO,微量震蕩10 min,使MTT完全溶解,于自動酶標儀在570 nm波長處測定各孔吸光度A值,實驗重復3次。</p><p>　　1.5 流式細胞儀測定細胞周期時相變化</p><p>　　取對數生長期的細胞,以5×105/mL密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,2

12、4 h后換無血清MEM/NEAA培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,換用不同濃度的40～400 μg/mL葛根素分別作用24 h。對照組不加藥,收集貼壁細胞,4 ℃預冷的PBS洗滌2次,制成單細胞懸液,70%乙醇固定,4 ℃保存過夜,-20 ℃保存,1周有效。檢測前用PBS洗去固定液,加入20 μL RnaseA,37 ℃孵育30 min后,暗處加PI染液,冰浴30 min,染色后以300目篩網過濾。調整細胞濃度為1×105/mL,上流式

13、細胞儀檢測,作細胞周期分析。</p><p>　　1.6 膠原的檢測[1]</p><p>　　采用MTT法檢測。取對數生長期的MRC-5,用MEM/NEAA培養(yǎng)液調整細胞數為1×105/mL,接種到96孔培養(yǎng)板中,每孔200 μL,37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),12 h后換用無血清培養(yǎng)液,24 h后換用含不同濃度葛根素培養(yǎng)液,另設不加藥的正常對照組,每組設4

14、個復孔。分別培養(yǎng)24、48、72、 96 h后吸去培養(yǎng)液,每孔加甲醇100 μL,-20 ℃固定一夜,PBS洗1次,天狼猩紅室染1 h,0.1%醋酸洗3次,每孔加入0.1 μmol/L 20 μL,室溫震蕩1 h,于酶標儀540 nm處檢測。</p><p>　　1.7 統(tǒng)計學方法</p><p>　　采用方差分析及t檢驗,實驗數據采用統(tǒng)計軟件SPSS10.0處理,MTT實驗結果以—x&

15、#177;s表示,P&lt;0.05認為有顯著性差異。</p><p><b>　　2 結果</b></p><p>　　2.1 葛根素對體外培養(yǎng)人胚肺MRC-5細胞增殖的影響</p><p>　　(見表1)表1 葛根素對體外培養(yǎng)人胚肺MRC-5細胞增殖的影響(略)注：與對照組比較,*P&lt;0.05,**P&l

16、t;0.01(下同)</p><p>　　MTT結果：葛根素濃度≥80 μg/mL時能顯著抑制MRC-5生長(P&lt;0.05)。40～400 μg/mL的濃度范圍,抑制強度隨濃度升高而加強(P&lt;0.05)。藥物作用時間24～96 h,抑制強度隨時間延長而加強(P&lt;0.05)。96 h時葛根素400 μg/mL對人胚肺MRC-5細胞增生抑制作用顯著(P&lt;0.01

17、)。</p><p>　　2.2 鏡下觀察葛根素處理后細胞形態(tài)的變化</p><p>　　對照組細胞：密度低時,細胞長梭形或三角形,有多個細胞質突起；細胞密度高時,以長梭形為主,排列緊密,放射狀或渦旋狀,邊界不清。用藥組細胞：胞體收縮,細胞變圓,細胞間隙增寬,分布松散；胞質內顆粒狀物增多；高劑量時部分細胞死亡破碎浮起。</p><p>　　2.3 膠原測定結果&

18、lt;/p><p>　　隨著葛根素濃度的增加,吸光度越來越小,當濃度≥200 μg/mL時,與正常組相比較具有顯著差異。這可能說明葛根素首先抑制細胞的生長,而抑制膠原合成是繼發(fā)的現象。結果見表2。表2 膠原測定結果（略）</p><p>　　2.4 流式細胞儀檢測細胞周期實相的分布</p><p>　　檢測結果顯示,正常對照組細胞其G0/G1期細胞百分比76.56、

19、80 μg/mL的葛根素處理細胞其G0/G1期細胞百分比為84.72。由檢測結果可知,隨著濃度的增大,G0/G1期細胞百分比越來越大,說明細胞阻滯于G0/G1期,而進入DNA合成期的細胞減少。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　肺纖維化是多種原因引起的慢性肺疾病的共同結局,是多種肺疾病發(fā)展到晚期的共同病理變化。其集中表現為成纖維細胞的

20、異常增殖和細胞外基質的過度沉積,在肺部,細胞外基質的主要成分之一膠原即來自于活化的成纖維細胞。由于纖維細胞的異常增殖及膠原的分泌增加在肺纖維化過程中起著重要作用[2],因此,抑制肺纖維細胞增殖是防治肺纖維化的一種有效手段。</p><p>　　本實驗以人胚肺成纖維細胞為靶細胞,研究葛根素對成纖維細胞增殖、形態(tài)學及膠原表達的影響。結果發(fā)現,葛根素能顯著抑制其增殖活力及DNA合成,將細胞阻止在G0/G1期,并呈劑量依

21、賴性；隨著劑量的遞增,其抑制作用也明顯增強。提示其可能有預防或延緩肺纖維化疾病進程的作用。有研究表明,在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中,Ⅰ、Ⅲ型膠原合成與降解失衡起主要作用,在肺泡炎階段或肺纖維化早期主要以Ⅲ型膠原增加為主,此期病變尚可逆轉,隨后病變轉為慢性,則以Ⅰ型膠原沉積為主,形成不可逆轉的改變[3-4]。天狼猩紅能與膠原緊密吸附,反應極其穩(wěn)定,染色后不褪色,具有特異性,是目前膠原染色最好的染料。在普通光鏡下觀察,膠原纖維呈紅色。本實驗通

22、過天狼猩紅染色發(fā)現葛根素組膠原表達明顯減弱。</p><p>　　綜上所述,葛根素可抑制人胚肺成纖維細胞增殖,使細胞周期停滯于G0/G1期,同時能減少膠原纖維的形成。提示葛根素可能通過抑制肺成纖維細胞增殖及膠原的合成分泌而起到抗肺纖維化作用。</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　[1] Branton MH,

23、Kopp JB. TGFβ1 and fibrosis[J]. Microbes Infect, 1999,1：1349－1365.</p><p>　　[2] 趙洪文.肺成纖維細胞在肺纖維化中的作用[J].國外醫(yī)學·呼吸系統(tǒng)分冊,1996,16(3)：116－117.</p><p>　　[3] 侯 杰,戴令娟.川芎嗪、丹參治療大鼠肺纖維化對Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因表達的影響[J].