MicroRNA-200c提高乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性研究.pdf

1、[目的]：
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，乳腺癌的發(fā)病率占女性惡性腫瘤的首位。近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅廣大女性的身心健康。放射治療是乳腺癌綜合治療的重要手段之一，可以提高乳腺癌患者的生存質(zhì)量及遠(yuǎn)期生存率。但由于個(gè)體之間或腫瘤細(xì)胞本身存在放射敏感性差異，以及臨床應(yīng)用中多種因素都會(huì)影響放療的效果，往往導(dǎo)致放療效果不佳。因此，在放療中，如何利用各種輔助手段降低腫瘤的輻射抗性，從而提高

2、腫瘤的輻射敏感性成為重要的研究課題。雖然人們很早就開始進(jìn)行該方面的研究，但迄今為止，一直未能找到一種較理想的低毒高效的輻射增敏劑應(yīng)用于臨床實(shí)踐。近年來(lái)，隨著microRNA(即miRNA)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療中都發(fā)揮了重要的作用。因此，從miRNA途徑研究提高腫瘤細(xì)胞輻射敏感性便成了一種極有發(fā)展前景的新思路。
　　 MiRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度約22nt、廣泛存在于動(dòng)植物中、對(duì)基因的調(diào)控起著重要作用

3、的單鏈非編碼小RNA。MiRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致靶mRNA降解或者抑制其翻譯，負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移等過(guò)程中，許多miRNA表達(dá)都發(fā)生了改變，主要有l(wèi)et-7家族，miR-34，miR-125a和125b，miR-200家族，miR-205，miR-10,miR-21，miR-17-92家族等。文獻(xiàn)報(bào)道，電離輻射可以引起miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變，外源

4、性給予miRNA可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性，如miR145，miR-7和miR-34等，但是乳腺癌的輻射敏感性可能還有其它miRNA參與調(diào)節(jié)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-200c在輻射致癌組織中明顯下調(diào)，增加其表達(dá)可以顯著增加細(xì)胞的DNA損傷。MiR-200c在許多腫瘤中通常扮演者腫瘤抑制基因的角色，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腫瘤EMT過(guò)程(epithelial-to-mesenchymaltransition)及侵襲和轉(zhuǎn)移的重要基因，其表達(dá)水平

5、的改變與腫瘤的預(yù)后有關(guān)，特別是它還與腫瘤化療藥物耐受有關(guān)，但其在腫瘤細(xì)胞的輻射耐受性或輻射敏感性方面是否發(fā)揮了一定的作用還未見報(bào)道。
　　 因此，本課題的目的就是研究miR-200c對(duì)乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性方面的影響，并探討其可能的分子機(jī)理，期望為提高乳腺癌的放射治療效果提供新出路。
　　 [方法]：
　　 本課題以兩株miR-200c表達(dá)不同的乳腺癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，分以下三個(gè)部分探討miR-200c對(duì)乳腺癌細(xì)

6、胞的輻射敏感性方面的影響及其機(jī)理。
　　 第一部分：miR-200c與乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的關(guān)系
　　 1、用細(xì)胞克隆形成法檢測(cè)兩株乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。
　　 2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)兩種乳腺癌細(xì)胞的miR-200c表達(dá)水平及輻射對(duì)miR-200c表達(dá)水平的影響。
　　 3、通過(guò)CCK8法和細(xì)胞克隆形成法檢測(cè)miR-200c抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的影響。
　　 第二部分：miR-20

7、0c對(duì)乳腺癌細(xì)胞的輻射增敏作用
　　 1、采用CCK8法和細(xì)胞克隆形成法檢測(cè)外源性增加miR-200c聯(lián)合γ射線照射對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖作用的影響。
　　 2、利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外源性增加miR-200c聯(lián)合γ射線照射對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡作用的影響。
　　 3、H2AXFoci免疫熒光法檢測(cè)外源性增加miR-200c聯(lián)合γ射線照射對(duì)乳腺癌細(xì)胞DNA雙鏈斷裂(DSB)的影響。
　　 第三部分：探討miR-200c

8、的輻射敏感性的分子機(jī)制
　　 1、用熒光定量PCR檢測(cè)給予去甲基化后乳腺癌細(xì)胞的miR-200c的表達(dá)變化。
　　 2、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，TBK1可能是miR-200c的直接靶點(diǎn)；并用雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和westernblot進(jìn)行驗(yàn)證；
　　 3、采用CCK8法和細(xì)胞克隆形成法檢測(cè)抑制TBK1表達(dá)后聯(lián)合γ射線照射對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖作用的影響
　　 4、檢測(cè)過(guò)表達(dá)TBK1是否可以逆轉(zhuǎn)miR-200c介導(dǎo)的輻射敏

9、感性。
　　 [結(jié)果]：
　　 第一部分：miR-200c與乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的關(guān)系
　　 1、MCF-7細(xì)胞(SF2，0.5±0.03)的miR-200c表達(dá)水平顯著高于MDA-MB-231細(xì)胞，而且輻射敏感性也高于MDA-MB-231細(xì)胞(SF2，0.8±0.53)。
　　 2、不同劑量γ射線照射后兩株乳腺癌細(xì)胞的miR-200c表達(dá)顯著上調(diào)，上調(diào)程度成劑量依賴性。
　　 3、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR

10、-200cinhibitor48h后可以顯著下調(diào)乳腺癌細(xì)胞的miR-200c表達(dá)水平。與單純照射組相比，外源性抑制miR-200c可以部分逆轉(zhuǎn)γ射線誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖抑制(CCK8法：細(xì)胞存活率從單純86y照射的75.5％提高到86.5％；細(xì)胞克隆形成法：細(xì)胞存活率從單獨(dú)4Gy照射的7.9％提高到15.8％)
　　 第二部分：miR-200c對(duì)乳腺癌細(xì)胞的輻射增敏作用
　　 1、與單純照射組相比，外源性增加miR-20

11、0c聯(lián)合γ射線照射抑制兩種乳腺癌細(xì)胞增殖，單獨(dú)給予miR-200c也可以抑制增殖。
　　 2、與單純照射組相比，外源性增加miR-200c聯(lián)合γ射線照射誘導(dǎo)兩種乳腺癌細(xì)胞的凋亡，單獨(dú)給予miR-200c也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如MDA-MB-231細(xì)胞，單純照射8Gy的凋亡率為11％，而照后過(guò)表達(dá)miR-200c組的凋亡率達(dá)30％以上。
　　 3、與單純照射組相比，外源性增加miR-200c聯(lián)合γ射線照射促進(jìn)兩種乳腺癌細(xì)胞的

12、DSB的H2AXfoci形成。如MCF-7細(xì)胞，對(duì)照組約有90％的細(xì)胞不含foci，而轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-200c組只有45％的細(xì)胞不含foci，33％的細(xì)胞含有成1-10個(gè)foci/cell。給予8Gy照射后，對(duì)照組有43％的細(xì)胞不含foci，而過(guò)表達(dá)miR-200c組只有17％細(xì)胞不含foci，高達(dá)37％的細(xì)胞含有＞10個(gè)loci/cell。MDA-MB-231細(xì)胞中也體現(xiàn)類似的結(jié)果。
　　 第三部分：探討miR-200c的輻射

13、敏感性的分子機(jī)制
　　 1、與空白組比較，給予甲基化抑制劑5-aza后可以上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)。
　　 2、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，miR-200c的可能靶點(diǎn)有很多，其中包括我們感興趣的蛋白TBK1。TBK13’UTR區(qū)存在與miR-200c的種子區(qū)互補(bǔ)的序列，提示，miR-200c可能靶向TBK1。
　　 雙熒光報(bào)告基因結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，miR-200c可以顯著抑制人TBK

14、13’UTR野生型的報(bào)告基因活性，而不能抑制人TBK13’UTR突變型的報(bào)告基因活性。此外，Westernblot結(jié)果顯示，miR-200c可以調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)TBK1蛋白的表達(dá)。
　　 3、沉默TBK1可以增加乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。與單純照射組相比，沉默TBK1表達(dá)后，聯(lián)合γ射線照射可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖(CCK8法：存活率從單純8Gy照射的88.1％降至66.8％；細(xì)胞克隆形成法：從單獨(dú)4Gy照射26.7％降到19.2％)

15、。
　　 4、通過(guò)過(guò)表達(dá)TBK1質(zhì)粒上調(diào)TBK1蛋白水平，可以部分逆轉(zhuǎn)miR-200c誘導(dǎo)的輻射增敏效果。過(guò)表達(dá)miR-200c的直接靶點(diǎn)ZEB1和ZEB2也能部分逆轉(zhuǎn)其輻射增敏效果。
　　 [結(jié)論]：
　　 1.首次提出miR-200c的低表達(dá)可能是導(dǎo)致腫瘤輻射耐受的原因之一。
　　 2.首次在實(shí)驗(yàn)中證明了miR-200c可以增加人類乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。
　　 3.首次成功預(yù)測(cè)并證明了TBK