線粒體DNA敲除細(xì)胞模型建立及輻射敏感性研究.pdf

1、目的:建立線粒體DNA敲除的支氣管上皮細(xì)胞株(HBE、BEAS-2B、A549)，觀察其細(xì)胞生物學(xué)特征和超微結(jié)構(gòu)的改變，并研究線粒體DNA敲除后細(xì)胞輻射敏感性的改變，為闡明氡致肺癌的作用機(jī)制提供細(xì)胞模型和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)資料。
　　 方法:1、線粒體DNA敲除支氣管上皮細(xì)胞系(ρ0)建立。采用溴化乙錠誘導(dǎo)建立線粒體DNA敲除細(xì)胞模型。將A549和HBE細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有50ng/ml和20ng/mlEB的DMEM的高糖培養(yǎng)基，BEAS-

2、2B細(xì)胞培養(yǎng)于含20ng/mlEB的已補(bǔ)加葡萄糖至4.5mg/ml的LHC-9培養(yǎng)基中，加入100μg/ml丙酮酸鈉、50μg/ml尿嘧啶和10％胎牛血清。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，含5％CO2的孵育箱中，每2～3天換液1次，每周傳代1～2次。30d后換用不含EB的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，有限稀釋法進(jìn)行克隆化，挑選其中1個(gè)克隆擴(kuò)增培養(yǎng)。用real-timePCR測(cè)定Ct值變化，觀察ρ0細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，用MitoTracker和PicoGreen活細(xì)胞染色

3、，驗(yàn)證ρ0細(xì)胞系的建立。2、ρ0細(xì)胞生物學(xué)特征改變。用CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)定ρ0細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的改變，用AnnexinV和PI染色測(cè)定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的改變，用流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體膜電位和ROS改變，用電鏡觀察線粒體缺失的細(xì)胞內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變。3、細(xì)胞輻射敏感性改變。用不同劑量a粒子照射ρ+和ρ0細(xì)胞，觀察生存狀況，用流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體膜電位和ROS改變，用試劑盒測(cè)定GSH含量改變。
　　 結(jié)果:1、加入溴化乙錠誘導(dǎo)30天后，

4、細(xì)胞在鏡下體積變大，線粒體出現(xiàn)腫脹?；罴?xì)胞染色顯示線粒體膜清晰可見(jiàn)，合并染色未見(jiàn)mtDNA，real-timePCR測(cè)定Ct值增高，說(shuō)明達(dá)到相同的拷貝數(shù)所需要的增值代數(shù)增加，線粒體mtDNA含量減少甚至消失。停加尿嘧啶5天后，細(xì)胞死亡。2、線粒體DNA敲除細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比例上升，S期細(xì)胞比例下降，出現(xiàn)G1-S期阻滯現(xiàn)象。ROS含量減少，細(xì)胞早期凋亡明顯增加。透視電鏡發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA敲除細(xì)胞的線粒體超微結(jié)構(gòu)有明顯變化，

5、主要表現(xiàn)為正常嵴及內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)部分或大范圍的溶解，線粒體自身的腫脹或髓磷體樣改變以及基質(zhì)的電子密度增高。3、與ρ+細(xì)胞相比，ρ0細(xì)胞經(jīng)α粒子照射后，線粒體膜電位降低明顯，活性氧隨照射劑量的增加而持續(xù)增高，同時(shí)抗氧化防御系統(tǒng)谷胱甘肽(GSH)含量降低。提示mtDNA敲除細(xì)胞的輻射敏感性高于正常細(xì)胞。
　　 結(jié)論:1、成功構(gòu)建了線粒體DNA敲除的支氣管上皮細(xì)胞系并用不同方法進(jìn)行了驗(yàn)證。2、線粒體DNA敲除細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能發(fā)生