大腸桿菌生物膜的形成及其耐藥質(zhì)粒傳遞和調(diào)控的研究.pdf

1、本研究以大腸桿菌為對象,針對其生物膜形成的兩個重要調(diào)節(jié)基因LuxS和pga操縱子開展研究,它們分別編碼大腸桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子合成酶和生物膜中多糖主要成分β-1-6-N-乙酰-葡聚糖胺合成酶,在細(xì)菌生物膜形成過程的初始黏附和生物膜成熟過程中均具重要的調(diào)節(jié)作用。本研究收集第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離的野生型大腸桿菌,對其耐藥性和形成生物膜的能力以及不同培養(yǎng)基對生物膜形成的影響因素進行分析;研究臨床分離株和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌形成的生物膜

2、內(nèi)耐藥質(zhì)粒的傳遞頻率;通過熒光定量PCR分析含0.5％糖的LB培養(yǎng)基對生物膜主要調(diào)控基因luxS和pga的表達的影響;構(gòu)建大腸桿菌CAG18439群體感應(yīng)系統(tǒng)信號合成酶基因luxS敲除株,研究luxS敲除株生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒傳遞的變化,并探討其機制。
　　 研究分四部分進行:
　　 1.臨床分離大腸桿菌的耐藥性和生物膜形成能力的研究;
　　 2.大腸桿菌CAG18439生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒傳遞的研究;
　　 3

3、.含糖(0.5％)LB培養(yǎng)基對生物膜的形成和主要調(diào)控基因luxS和pga表達的影響;
　　 4.luxS基因敲除大腸桿菌株生物膜形成及其對耐藥質(zhì)粒傳遞的影響。
　　 材料和方法
　　 1.材料
　　 臨床分離大腸桿菌共127株,均分離于第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2005年7月～2007年12月住院患者的臨床送檢標(biāo)本;大腸桿菌ATCC25922、DH5α(PGreenTIR-)(F-,(φ)80d lacZ△

4、M15,△(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+)和MG1655為重慶西南醫(yī)院國家藥品臨床研究基地保存菌株;大腸桿菌CAG18439(F,lacZ118(Oc),lacI3042::Tn10,LAM-rph-1)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院徐琪壽教授饋贈;DH5α(PGreenTIR+),含原核綠色熒光表達非接合型質(zhì)粒,由武漢大學(xué)病毒研究所李果博士饋贈。
　　 2.方法
　　

5、 2.1臨床分離大腸桿菌的耐藥性和生物膜形成能力的研究
　　 2.1.1127株臨床分離大腸桿菌對10種常用藥物的MIC測定
　　 頭孢他定、氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨曲南、頭孢哌酮、左氧沙星、氨芐西林、氨芐西林/克拉維酸和亞胺培南對臨床分離大腸桿菌的敏感性實驗,采用瓊脂倍比稀釋法;
　　 2.1.2127株臨床分離大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌株攜帶常見β-內(nèi)酰胺酶基因的PCR檢測
　　 根據(jù)127株

6、大腸桿菌的藥敏結(jié)果,選擇頭孢他定和頭孢哌酮耐藥株以及在256μg/ml的濃度下氨芐西林/克拉維酸可以逆轉(zhuǎn)氨芐西林耐藥的菌株,根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn),篩選耐藥大腸桿菌,對TEM等7種β-內(nèi)酰胺酶基因的檢測,采用PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳驗證,選擇1個陽性產(chǎn)物測序;臨床分離大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因的同源性分析,采用擴增產(chǎn)物測序在Genebank序列比對。
　　 2.1.3127株臨床分離大腸桿菌形成生物膜的研究
　　 大腸桿菌在LB培

7、養(yǎng)基中生物膜形成的檢測,采用96孔板結(jié)晶紫染色法;大腸桿菌形成生物膜的能力和細(xì)菌耐藥性的相關(guān)性分析,采用非配對t檢驗;
　　 2.2大腸桿菌CAG18439生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒傳遞的研究
　　 2.2.1大腸桿菌CAG18439攝取外源耐藥質(zhì)粒pGreenTIR的研究
　　 pGreenTIR質(zhì)粒的提取采用堿裂解法;對檢測生物膜中細(xì)菌攝取質(zhì)粒的GFP標(biāo)記法和96孔板抗性篩選法進行方法學(xué)探討,確定觀察方法;比較加入文獻

8、報道生物膜DNA含量的等量外源性質(zhì)粒濃度時,大腸桿菌ATCC25922、MG1655、臨床分離低耐藥株S17(對氨芐青霉素敏感)、DH5α和CAG18439在接種后24h對質(zhì)粒的攝取頻率。研究大腸桿菌CAG18439株接種后不同時間點(4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h)以及接種后24h不同外源性質(zhì)粒濃度(0.5μg/ml、1μg/ml,2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml)時對質(zhì)粒的攝取頻率的變化;并加入文獻報道生

9、物膜DNA含量的等量外源性質(zhì)粒濃度,測定生物膜細(xì)菌和浮游菌接種后24h和48h時的質(zhì)粒攝取頻率。
　　 2.2.2不同培養(yǎng)基對大腸桿菌CAG18439與DH5α(PGreenTIR+)共生形成生物膜過程中細(xì)菌間質(zhì)粒傳遞的研究
　　 2.2.2.1共生培養(yǎng)耐藥質(zhì)粒最佳觀察時間的確定,以常規(guī)LB培養(yǎng)基(pH7.4)共生培養(yǎng)DH5α(PGreenTIR+)與CAG18439形成生物膜過程中耐藥質(zhì)粒的傳遞,96孔板雙抗性篩選法檢

10、測細(xì)菌接種后4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h耐藥質(zhì)粒的傳遞頻率。
　　 2.2.2.2不同培養(yǎng)基對大腸桿菌CAG18439與DH5α(PGreenTIR+)共生形成生物膜過程中細(xì)菌間質(zhì)粒傳遞的影響。以常規(guī)LB培養(yǎng)基(pH7.4)為對照,按2.2.2.1確定時間,96孔板雙抗性篩選法檢測細(xì)菌接種于不同培養(yǎng)基:含0.5％糖或100mMCaCl2的常規(guī)LB和TSB培養(yǎng)基(pH7.4)、偏酸(pH6)和偏堿(pH9)L

11、B培養(yǎng)基共生培養(yǎng)DH5α(PGreenTIR+)與CAG18439形成生物膜過程中測定質(zhì)粒傳遞的頻率;相同條件下測定大腸桿菌生長曲線。
　　 2.3含糖(0.5％)LB培養(yǎng)基對生物膜的形成和主要調(diào)控基因luxS和pga表達的影響
　　 2.3.1127株臨床分離大腸桿菌生物膜形成的主要調(diào)控基因luxS和pga的PCR檢測
　　 大腸桿菌生物膜形成相關(guān)基因pga和luxS的檢測,采用PCR方法擴增,瓊脂糖凝膠電泳驗

12、證。
　　 2.3.2含糖(0.5％)LB培養(yǎng)基對大腸桿菌株生物膜的形成及其luxS和pga基因表達的影響
　　 127株臨床分離株和4株實驗室菌株(ATCC25922、DH5α、MG1655和CAG18439),含0.5％糖的LB培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基中細(xì)菌生物膜形成能力采用96孔板結(jié)晶紫染色法,采用配對t檢驗分析;分別選擇生物膜形成增強和減弱最明顯的菌株,采用熒光定量PCR方法檢測pga和luxS的表達。
　　

13、2.4 luxS基因敲除大腸桿菌株生物膜形成及其對耐藥質(zhì)粒傳遞的影響
　　 3.主要結(jié)果
　　 3.1臨床分離大腸桿菌的耐藥性和生物膜形成能力的研究
　　 3.2大腸桿菌CAG18439生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒傳遞的研究
　　 3.3含糖(0.5％)LB培養(yǎng)基對生物膜的形成及其主要調(diào)控基因luxS和pga表達的影響
　　 3.4 luxS基因敲除大腸桿菌株生物膜形成及其對耐藥質(zhì)粒傳遞的影響
　　

14、4.全文結(jié)論
　　 4.1臨床分離大腸桿菌的耐藥率較高,并存在一株細(xì)菌攜帶多個β-內(nèi)酰胺酶耐基因,一種β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因分布于多個細(xì)菌的情況,在正常培養(yǎng)條件下幾乎全部的菌株都可以形成生物膜,但其形成生物膜的能力有較大差異,菌株的耐藥性與生物膜形成能力之間沒有顯著差異。
　　 4.2細(xì)菌生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒的傳遞存在菌株特異性,在生物膜初始形成時發(fā)生的頻率最高,且這種轉(zhuǎn)化頻率隨質(zhì)粒濃度的增加而增高,但無線性關(guān)系;不同培養(yǎng)基和

15、鈣離子的存在對生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒的傳遞影響不明顯,表明這種耐藥質(zhì)粒的傳遞機制是完全不同于常規(guī)的轉(zhuǎn)化途徑。
　　 4.3127株大腸桿菌均存在pgaA、pgaB、pgaC、pgaD和luxS基因,提示pga和luxS基因具有較高的保守性;含0.5％的糖的LB培養(yǎng)基對不同菌株可以表現(xiàn)為對細(xì)菌生物膜形成能力的增強和減弱,細(xì)菌pga基因的表達與其作用相一致;但無論是在生物膜形成能力增強還是在生物膜形成能力減弱的菌株,luxS基因的表達均表

16、現(xiàn)為上調(diào),表明luxS作為生物膜形成的上游調(diào)控基因,對外界環(huán)境的變化反應(yīng)靈敏,而pga只是生物膜調(diào)控的效應(yīng)基因,其表達強弱與生物膜的形成強弱一致。在pga基因固有表達就低的菌株,即使環(huán)境因素導(dǎo)致luxS基因表達上調(diào),生物膜的形成仍不會增強。
　　 4.4大腸桿菌CAG18439luxs基因缺失株生物膜形成能力下降,生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒的傳遞頻率降低,其機制可能是luxS突變導(dǎo)致pga的表達下調(diào),生物膜形成能力下降,同時細(xì)菌裂解釋放游