巰乙磺酸鈉對大腸桿菌生物膜的干預(yù)作用及機制研究.pdf

1、第一部分，巰乙磺酸鈉對大腸桿菌生物膜早期黏附及胞外聚合物的影響
　　[目的]研究巰乙磺酸鈉對大腸桿菌生物膜(biofilm，BF)早期黏附及胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)的影響。
　　[方法]瓊脂平板稀釋法檢測巰乙磺酸鈉對大腸桿菌ATCC25922的最低抑菌濃度(mimmum innbitoy concentrmion，MIC)；采用了平板菌落計數(shù)法檢測高濃度、低濃

2、度巰乙磺酸鈉(2mg/ml、0.5mg/ml)在不同時間點(2、4、6、8h)對大腸桿菌黏附的影響；采用免疫熒光技術(shù)標記多糖和細菌，利用激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)定性觀察細菌黏附及胞外多糖變化；利用硫酸-苯酚法定量各組細菌胞外多糖的產(chǎn)量；利用考馬斯亮藍染料結(jié)合法(Bradford法)測定胞外蛋白含量。
　　[結(jié)果]巰乙磺酸鈉干預(yù)2、4、6、8h后，與生理鹽水對照組比較，各組黏附細菌數(shù)均有所減少(F值分別為31.038、11.

3、180、80.686、10.362，P<0.05)，高濃度組較低濃度組更明顯(P<0.05)；經(jīng)巰乙磺酸鈉干預(yù)8h后，經(jīng)FITC-ConA和PI雙染，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察見菌落稀疏，散在分布，胞外多糖減少，稀薄，以高濃度為甚；胞外多糖定量實驗中，胞外多糖(μg)/細菌干重(mg)在高濃度組為(13.57±0.59)，在低濃度組為(27.77±0.77)，分別與生理鹽水對照組(35.73±0.44)比較，均降低了胞外多糖的產(chǎn)生(F=3

4、332.150，P<0.05)，高濃度組較低濃度組更明顯(P<0.05)；胞外蛋白定量實驗中，胞外蛋白(μg)/細菌干重(mg)在高濃度組為(7.76±0.32)，在低濃度組為(17.59±0.86)，分別與生理鹽水對照組(23.31±1.36)比較，均降低了胞外蛋白的產(chǎn)生(F=688.129，P<0.05)，高濃度組較低濃度組更明顯(P<0.05)。
　　[結(jié)論]巰乙磺酸鈉能顯著減少大腸桿菌生物膜的早期黏附，也能減少大腸桿菌生物

5、膜胞外多糖及胞外蛋白的生成。
　　第二部分，巰乙磺酸鈉對大腸桿菌生物膜形成的影響以及單獨和聯(lián)合環(huán)丙沙星大腸桿菌BF的作用
　　[目的]研究巰乙磺酸鈉對大腸桿菌生物膜(biofilm，BF)形成的影響，以及單獨及聯(lián)合環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)成熟大腸桿菌BF的作用。
　　[方法]瓊脂平板稀釋法檢測CIP對大腸桿菌ATCC25922的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentra

6、tion，MIC)；掃描電鏡觀察巰乙磺酸鈉對大腸桿菌BF形成的作用；平板計數(shù)法檢測巰乙磺酸鈉單獨及與CIP聯(lián)用后BF內(nèi)活菌數(shù)；用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanningmicroscopy，CLSM)觀察巰乙磺酸鈉對成熟的大腸桿菌BF空間結(jié)構(gòu)的影響并結(jié)合BF圖像結(jié)構(gòu)分析軟件(image structure analyer，ISA)定量分析BF結(jié)構(gòu)參數(shù)。
　　[結(jié)果]CIP對大腸桿菌ATCC25922的MIC

7、是0.25μg/ml；巰乙磺酸鈉能減少BF中基質(zhì)樣物質(zhì)以及被膜的厚度；單用巰乙磺酸鈉，8mg/ml才能使BF中的活菌數(shù)減少(P<0.05)，單用CIP，1MIC才可使BF中活菌數(shù)降低(P<0.05)，小劑量巰乙磺酸鈉(1mg/ml)與1/2 MIC的CIP聯(lián)合應(yīng)用就可使BF上的活菌數(shù)明顯減少(P<0.05)；CLSM圖像顯示經(jīng)巰乙磺酸鈉作用后的BF厚度逐漸減少，密度逐漸稀疏；ISA軟件定量分析顯示：5mg/ml巰乙磺酸鈉作用后，BF厚度

8、變小(F=67.880，P<0.05)、平均擴散距離(average diffusion distance，ADD)(F=15.977，P<0.05)和結(jié)構(gòu)熵(textual entropy，TE)均減少(F=39.432，P<0.05)，區(qū)域孔率(areal porosity，AP)增加(F=25.100，P<0.05)，2mg/ml巰乙磺酸鈉干預(yù)后效果不如高濃度明顯。
　　[結(jié)論]巰乙磺酸鈉能夠抑制大腸桿菌BF形成，也能破壞成

9、熟大腸桿菌BF形態(tài)結(jié)構(gòu)；巰乙磺酸鈉與環(huán)丙沙星存在協(xié)同作用，增強其抗大腸桿菌生物膜的能力。
　　第三部分，巰乙磺酸鈉對留置導(dǎo)尿管大腸桿菌生物膜的體內(nèi)干預(yù)作用
　　[目的]構(gòu)建留置導(dǎo)尿管大腸桿菌生物膜(biofilm，BF)體內(nèi)模型；研究巰乙磺酸鈉(Mesna)對留置導(dǎo)尿管大腸桿菌BF的的體內(nèi)干預(yù)作用及對導(dǎo)尿管相關(guān)性尿路感染(catheter-associated urinary tract infections，CAUTI)的

10、影響。
　　[方法]1、構(gòu)建留置導(dǎo)尿管大腸桿菌BF體內(nèi)模型，分為模型組及對照組，家兔行導(dǎo)尿術(shù)，模型組家兔經(jīng)導(dǎo)尿管注入大腸桿菌菌液4天，掃描電鏡(SEM)及平板計數(shù)法檢測留置導(dǎo)尿管大腸桿菌BF動物模型構(gòu)建情況；2、巰乙磺酸鈉對導(dǎo)尿管大腸桿菌BF的體內(nèi)干預(yù)作用，建立留置導(dǎo)尿管大腸桿菌BF體內(nèi)模型后，實驗分為對照組、生理鹽水(NS)組(NS，5ml，膀胱灌注，2次/日)、Mesna組(mesna，20mg/ml×5ml，膀胱灌注，2次/

11、日)、頭孢他啶(CAZ)組(CAZ，50mg/kg，靜滴，2次/日)、Mesna+CAZ組(mesna，20mg/ml×5ml，膀胱灌注，2次/日+CAZ50mg/kg，靜滴，2次/日)，每日取尿袋內(nèi)尿液行菌落計數(shù)，3天后處死家兔，掃描電鏡(SEM)觀察導(dǎo)尿管表面大腸桿菌BF形態(tài)改變，平板菌落計數(shù)法檢測導(dǎo)尿管表面及膀胱壁黏附細菌數(shù)，HE染色觀察膀胱組織病理改變，ELISA檢測血漿中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。
　　[結(jié)

12、果]1、在建立模型實驗中，模型組可見大量細菌在導(dǎo)尿管上呈團狀或膜狀黏附生長，厚薄不均的黏液狀物質(zhì)連接成一大片，平均菌落計數(shù)模型組為(4.78±0.28)(Log10CFU)較對照組(1.05±0.10)(Log10CFU)明顯增多(t=17.44，P<0.01)；2、在干預(yù)實驗中，Mesna組在第二天能使尿袋中細菌減少；Mesna組較CAZ組更明顯地破壞了留置導(dǎo)尿管表面大腸桿菌BF形態(tài)及減少了導(dǎo)尿管上細菌數(shù)；Mesna組及CAZ組均能使

13、膀胱壁黏附細菌數(shù)減少，聯(lián)合治療組更明顯；對照組及NS組可見膀胱粘膜破損，粘膜細胞充血、水腫，大量炎癥細胞侵潤；Mesna組及CAZ組黏附完好，細胞充血、水腫減輕，炎癥細胞少；聯(lián)合治療組黏膜完好，細胞充血、水腫進一步減輕，炎癥細胞侵潤進一步減少；對照組、NS組、Mesna組、CAZ組及Mesna+CAZ組IL-1β含量分別為397.97±100.75、402.87±109.81、287.35±65.05、257.81±78.36、138.

14、61±55.71(pg/ml)(F=12.650，P<0.05)，TNF-α的含量分別為525.30±81.09、491.94±138.54、251.12±79.51、254.60±78.36、135.68±46.77(pg/ml)(F=28.207，P<0.05)IL-6的含量的分別840.60±106.92、837.39±120.67、556.17±108.57、446.32±129.33、188.54±43.65(pg/ml)(F

15、=54.184，P<0.05)，巰乙磺酸鈉降低了IL-1β、TNF-α、IL-6水平，聯(lián)合治療更明顯。
　　[結(jié)論]留置導(dǎo)尿管表面大腸桿菌BF動物模型成功建立；巰乙磺酸鈉對體內(nèi)留置導(dǎo)尿管表面大腸桿菌BF有破壞作用，能降低細菌對膀胱的黏附，并能減輕膀胱病理變化，減輕由IL-1β、TNF-α、IL-6導(dǎo)致的尿路免疫損傷，聯(lián)合頭孢他啶治療作用更明顯。
　　第四部分，巰乙磺酸鈉對大腸桿菌黏附蛋白及胞外多糖生成相關(guān)基因的作用
　

16、　[目的]研究不同濃度巰乙磺酸鈉對大腸桿菌flu、fimH，papC，glmS、glmU、msbB、IpxA基因表達的作用，為巰乙磺酸鈉抗大腸桿菌生物膜作用提供機制。
　　[方法]實驗分為四組：對照組、巰乙磺酸鈉0.5mg/ml組、巰乙磺酸鈉2mg/ml組、巰乙磺酸納5mg/ml組；將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌ATCC25922菌液稀釋至OD(600)=0.05，分別加入相同體積的LB培養(yǎng)基、0.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml的

17、巰乙磺酸鈉，2h后收集菌液。運用實時定量PCR檢測各組基因的相對表達量。
　　[結(jié)果]與對照組相比，巰乙磺酸鈉0.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml組的flu基因的相對表達量分別為0.587±0.058、0.334±0.054、0.480±0.075，2mg/ml時最低，5mg/ml則較2mg/ml組升高；fimH基因的相對表達量分別為0.601±0.014、0.370±0.064、0.407±0.056在2mg/ml、5m

18、g/ml時降低明顯(P<0.05)；papC基因的相對表達量分別為0.628±0.06、0.278±0.072、0.30±0.0053，在2mg/ml和5mg/ml組較0.5mg/ml組明顯下降(P<0.05)；glmS基因的相對表達量分別為0.624±0.105、0.378±0.085、0.469±0.105，在2mg/ml、5mg/ml時最低(P<0.05)；glmU基因的相對表達量分別為0.585±0.062、0.285±0.07

19、5、0.172±0.007，隨濃度升高表達下降，在5mg/ml時下降最明顯(P<0.05)；msbB基因的相對表達量分別為0.697±0.096、0.52±0.088、0.36±0.045，并隨濃度升高表達下降，5mg/ml時下降最明顯(P<0.05)：lpxA基因的相對表達量分別為0.937±0.146、0.632±0.125、0.761±0.09，在0.5mg/ml組與對照組比較無顯著性差異，但在2mg/ml、5mg/ml時均出現(xiàn)下