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文檔簡介
1、本課題用Red同源重組技術(shù)敲除鴨源大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(O73)多重耐藥調(diào)控基因marA,構(gòu)建marA基因缺失突變株(O73△marA),并采用微量稀釋法測定5種抗生素對其的最小抑菌濃度。應(yīng)用熒光定量PCR方法,檢測O73、O73△marA及其不同藥物誘導(dǎo)時有關(guān)主動外排基因、調(diào)控基因的mRNA相對表達(dá)量,旨在探討多重耐藥耐性產(chǎn)生及其調(diào)控機(jī)制。
利用PCR擴(kuò)增兩翼與目的基因上下游同源、含有卡那霉素抗性基因片段,電擊轉(zhuǎn)化O73/46。
2、在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)下,含有質(zhì)粒pKD46的菌株O73表達(dá)λ噬菌體的3個重組蛋白,在Red同源重組系統(tǒng)表達(dá)重組酶的幫助下,含卡那抗性基因的PCR產(chǎn)物通過其兩側(cè)的marA基因同源序列與鴨大腸桿菌染色體上的marA基因發(fā)生同源重組,通過卡那霉素抗性平板篩選得到陽性克隆,結(jié)合PCR擴(kuò)增和測序鑒定,證明△marA突變株正確構(gòu)建。還利用PCR分別擴(kuò)增O73marA基因的上下游序列和質(zhì)粒pkD4的卡那抗性基因,分別連接T載體pET-28,再通過酶切連
3、接的方法分別將marA基因的上、下游連接到pET-28-kan質(zhì)粒上,構(gòu)建同源重組質(zhì)粒PET-28-marA,同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α擴(kuò)增后,提取質(zhì)粒雙酶切獲得同源重組片段,將同源重組片段電轉(zhuǎn)化至O73中,利用含有同源臂的卡那霉素抗性片段分別替換目的基因marA。測定O73和O73△marA對的MIC值。慶大霉素、頭孢噻呋、恩若沙星、多西環(huán)素對O73△marA的MIC值較O73顯著下降,對O73的MIC值分別為2、2和4μg/mL,對O
4、73△marA的MIC值分別為0.125、0.125、0.5μg/mL。
慶大霉素、頭孢噻呋、氟苯尼考、恩若沙星、多西環(huán)素五種藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌株O73和缺失株O73△marA至40代,通過熒光定量PCR檢測有關(guān)主動外排基因和調(diào)節(jié)基因mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果表明:未經(jīng)藥物誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)菌株敲除前與敲除后,acrA,acrB,TolC,acrD,acrE,acrF,soxS,robA基因mRNA的相對表達(dá)量均有所下降介于(0.04~
5、0.74之間)。其中acrD基因的相對表達(dá)量為0.04,下降最高;而acrE基因的相對表達(dá)量為0.74,下降最低。O73經(jīng)5種藥物誘導(dǎo)后,其主動外排基因mRNA的表達(dá)量大多上升,其相對表達(dá)量介于0.12~2.73之間。其中,經(jīng)多西環(huán)素誘導(dǎo)至高度耐藥時,tolC基因的相對表達(dá)量為2.43,上升2倍。O73經(jīng)頭孢噻呋誘導(dǎo)至高度耐藥時,acrE基因的相對表達(dá)量為0.12,下降最高。acrA、acrB、TolC、acrD、acrE、acrF、s
6、oxS、robA基因與未經(jīng)藥物誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較,相對表達(dá)量均未顯著的變化。
O73△marA經(jīng)以上藥物誘導(dǎo)后,各主動外排基因mRNA的相對表達(dá)量介于1.50~55.33之間。O73△marA經(jīng)頭孢噻呋誘導(dǎo)后,acrF基因的相對表達(dá)量為1.50,上升最低,上升1.5倍;經(jīng)恩若沙星誘導(dǎo)后,tolC基因的相對表達(dá)量為55.33,上升55倍。與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較,敲除株O73△marA誘導(dǎo)后,其主動外排基因的表達(dá)量顯著上升。acrA、
7、acrB、TolC、acrD、acrE,acrF、soxS、robA的相對表達(dá)量較未誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別上升55、20、16、43、16、25、17、19倍,較O73△marA未誘導(dǎo)時上升251、57、30、464、23、27、72、76倍。O73、O73△marA在慶大霉素誘導(dǎo)前后,8種主動外排基因、2種調(diào)控基因mRNA相對表達(dá)量水平比較:O73誘導(dǎo)到高度耐藥(40代)時與O73標(biāo)準(zhǔn)菌株接近,O73△marA誘導(dǎo)株(40代)遠(yuǎn)高于未誘導(dǎo)
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