新型生物可降解支架材料的生物學特性研究和支架法聯(lián)合大網(wǎng)膜修復(fù)膽道損傷的動物實驗研究.pdf

1、第一部分聚癸二酸丙二醇聚酯的制備及吻合支架的制造
　　研究目的:制備一種新型生物可降解高分子材料，并以此制造一系列空腔臟器吻合支架。
　　研究方法:將癸二酸、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇以2:3.75:1.25的摩爾比通過熔融縮聚二步法完成材料制備，經(jīng)無水甲醇提純。制備的材料采用凝膠滲透色譜(GPC)法測定其分子量，采用紅外圖譜表征合成產(chǎn)物。根據(jù)吻合支架設(shè)計模型鑄造相應(yīng)模具，然后通過注塑的方法制備相應(yīng)的支架。
　　結(jié)

2、果:通過熔融縮聚的方法成功制備了目標產(chǎn)物聚癸二酸丙二醇聚酯(PSPP)，重均分子量為67000左右，數(shù)均分子量為30000左右，分布寬度為2.2。紅外譜圖中分別在1161 cm-1、1728 cm-1、2927 cm-1、2851 cm-1出現(xiàn)吸收峰。以制備的PSPP材料通過注塑的方法制得各種空腔臟器吻合支架。
　　結(jié)論:以癸二酸、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇為單體，采用熔融縮聚法成功制備了PSPP。通過注塑法制造了一系列空腔臟

3、器吻合支架。
　　第二部分聚癸二酸丙二醇酯的生物相容性實驗研究
　　研究目的:通過體外和體內(nèi)生物相容性實驗，系統(tǒng)評價新型生物可降解聚酯材料PSPP的生物相容性，為進一步動物實驗和臨床研究提供實驗依據(jù)。
　　研究方法:依據(jù)我國頒布的醫(yī)療器械生物學評價指南(GB/T16886.2008)，選擇細胞毒性試驗、Ames試驗作為體外試驗項目，全身毒性試驗、皮內(nèi)反應(yīng)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、植入試驗和直腸黏膜刺激試驗作為體內(nèi)試驗項目來對P

4、SPP的生物相容性進行評估。
　　結(jié)果:(1)體外試驗：細胞毒性試驗據(jù)24h、48h和72h觀察，PSPP浸提液組的細胞相對增殖率RGR值均在75％以上，毒性判定均為1級；Ames試驗在活化或非活化代謝條件下，PSPP組。TA97、TA98、TA100和TA102的菌株回變菌落數(shù)均與陰性對照組相接近，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)且PSPP組回復(fù)突變菌落數(shù)均未超過陰性對照組2倍，判斷為陰性。(2)體內(nèi)試驗：皮內(nèi)注射24h、48h、7

5、2h后觀察每只動物在每一規(guī)定的觀察時間內(nèi)的原發(fā)性刺激記分均為0；全身毒性反應(yīng)試驗分別自尾靜脈注射供試液和空白對照液4h、24h、48h和72h后，兩組動物未出現(xiàn)死亡，進食正常，無嘔吐、呆滯、運動機能減退、呼吸困難等癥狀出現(xiàn)；遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗PSPP加和不加弗氏完全佐劑情況下，在致敏后第3天和第7天及激發(fā)后24h和48h，皮膚過敏反應(yīng)評分均為0分；直腸黏膜刺激試驗連續(xù)直腸灌注1周后通過肉眼觀察，結(jié)合組織病理學檢查，未見直腸給藥部位出現(xiàn)充

6、血、紅腫及壞死現(xiàn)象；植入試驗大體標本觀察，實驗組和陰性對照組2w時可見周圍組織輕度水腫，4w、12w均可見材料被一薄層囊壁包繞，與周圍組織無明顯粘連，未發(fā)現(xiàn)周圍組織有充血、水腫、壞死等異常情況，組織學觀察2w時兩組炎癥細胞反應(yīng)均為Ⅳ級，囊腔反應(yīng)均為Ⅳ級，4w時炎癥細胞反應(yīng)均為Ⅲ級，囊腔反應(yīng)均為Ⅱ級，12w時炎癥細胞反應(yīng)均為Ⅰ級，囊腔反應(yīng)均為Ⅰ級。
　　結(jié)論:PSPP無論在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出良好的生物相容性。
　　第三部分聚癸

7、二酸丙二醇酯的生物降解性能研究
　　研究目的:研究聚癸二酸丙二醇酯(PSPP)在體外和動物體內(nèi)不同介質(zhì)中的降解規(guī)律，明確影響PSPP降解速度的主要因素，了解PSPP在消化道不同部位的降解時間。
　　研究方法:體外降解選擇人新鮮膽汁、模擬胃液和模擬腸液為降解介質(zhì)，PSPP支架為樣本，每種介質(zhì)各設(shè)立48個樣本。每個支架獨立浸泡于裝有10ml降解介質(zhì)的平底試管內(nèi)，37℃，100轉(zhuǎn)/分鐘持續(xù)振蕩，每日更換浸提介質(zhì)。每周每種介質(zhì)分別取

8、出3個樣本用來觀察外觀和完整性，檢測重量和重均分子量，掃描電鏡下觀察表面形態(tài)改變，觀察期為4個月或至支架崩解.體內(nèi)降解以巴馬小型豬為實驗對象，選擇小腸、胃、結(jié)腸三個部位進行試驗，樣品5個為1串，分別懸掛在相應(yīng)的消化道內(nèi)。小腸每4天處死一頭動物，共4頭，胃和結(jié)腸每周處死1頭，各6頭。取出樣本后分別觀察形態(tài)變化，分子量變化，掃描電鏡觀察表面形態(tài)改變。
　　結(jié)果:在體外人新鮮膽汁中，PSPP支架的降解周期約為3.5個月，觀察期內(nèi)總失重將

9、近60％，重均分子量從原來的67000左右降低到31000左右，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)支架表面逐漸呈魚鱗樣改變伴脫落；在模擬胃液中，4個月內(nèi)支架外形保持完整，支架的重量，重均分子量及支架表面形態(tài)改變均不明顯；在模擬腸液中降解周期約為2.5個月，失重46％左右，重均分子量降至30000左右，掃描電鏡下，材料表面呈魚鱗樣改變。體內(nèi)降解中，空腸內(nèi)的降解周期約為2周，重均分子量變化不明顯，掃描電鏡下材料表面明顯被腐蝕；胃內(nèi)降解6周支架厚度變化不明顯，重均

10、分子量稍有下降，掃描電鏡下材料表面變得粗糙伴少量空洞；結(jié)腸內(nèi)5周左右降解，重均分子量呈逐漸下降趨勢，掃描電鏡下材料表面被腐蝕。
　　結(jié)論:在體外人新鮮膽汁中，PSPP支架的降解周期約為3.5個月，在模擬腸液中降解周期約為2.5個月，在模擬胃液中降解周期在4個月以上，堿性性環(huán)境有助于PSPP降解，酸性環(huán)境中，PSPP表現(xiàn)為相對生物惰性，膽汁的乳化功能和胰酶均對PSPP降解起到明顯促進作用。在體內(nèi)，PSPP支架在空腸內(nèi)降解速度快，時間

11、約為2周，和小腸吻合口愈合時間相匹配；結(jié)腸內(nèi)約為5周左右；胃內(nèi)降解速度慢，表現(xiàn)相對惰性。
　　第四部分內(nèi)支架聯(lián)合大網(wǎng)膜修復(fù)膽道熱損傷的動物實驗研究
　　研究目的:通過動物實驗驗證內(nèi)支架聯(lián)合大網(wǎng)膜修復(fù)膽道熱灼傷伴穿孔的可行性和安全性。
　　研究方法:以巴馬小型豬為實驗對象，隨機分為兩組，每組16頭。手術(shù)構(gòu)建膽總管側(cè)壁熱灼傷伴穿孔的模型，實驗組采用內(nèi)支架聯(lián)合大網(wǎng)膜修補膽管：修剪灼傷膽管后將PSPP支架與膽管兩端荷包捆綁連接

12、，缺損部分由大網(wǎng)膜覆蓋；對照組采用膽管間斷縫合。術(shù)后觀察實驗動物黃疸和膽漏情況；各組分別于術(shù)后2周、1月、3月和6月處死4頭動物并取材，觀察兩組的吻合口愈合情況，比較大體觀、膽道造影情況及組織病理形態(tài)學改變，包括HE染色和Masson染色，采用免疫組化和定量PCR法測定吻合口a-SMA、TGF-β1和b-FGF的相對含量。
　　結(jié)果:兩實驗組均順利完成手術(shù)，術(shù)后無黃疸及膽漏發(fā)生。將兩組術(shù)后肝功能和膽紅素的變化值進行比較分析，發(fā)現(xiàn)對

13、照組術(shù)后2周和1月時ALP變化明顯大于實驗組，術(shù)后3月AST升高明顯高于實驗組，術(shù)后6月DBiL變化明顯高于實驗組。膽道造影顯示實驗組膽管無明顯狹窄，對照組術(shù)后3月有一頭實驗動物吻合口線樣狹窄伴膽總管擴張，對照組術(shù)后6月有2頭動物見近端膽管和肝內(nèi)膽管擴張，吻合口可觸及疤痕狹窄。HE染色和Masson染色均顯示術(shù)后各時段實驗組的吻合口炎癥和纖維增生情況較對照組輕。免疫組化顯示術(shù)后各時間段實驗組的a-SMA和TGF-β1評分低于對照組，b-

14、FGF評分高于對照組。熒光定量PCR結(jié)果顯示術(shù)后2周時實驗組較對照組b-FGF、TGF-β1 mRNA表達略增加，α-SMAmRNA表達明顯減少；術(shù)后1月時實驗組較對照組b-FGF mRNA表達增加，TGF-β1、α-SMA mRNA表達明顯減少；術(shù)后3月時實驗組較對照組b-FGF、a-SMAmRNA表達略減少，TGF-β1 mRNA表達明顯減少；術(shù)后6月時實驗組較對照組b-FGF和a-SMA mRNA表達相似，TGF-β1mRNA減少