前額葉皮層突觸前Sigma-1受體對D1受體的協(xié)同作用及機制.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分、前額葉皮層突觸前Sigma-1受體對D1受體的協(xié)同作用及機制
　　 Sigma受體早在1976年就被Martin等人發(fā)現(xiàn)，是非阿片、非苯環(huán)利定類受體。藥理學分析表明sigma受體包括2個亞型：sigma-1和sigma-2受體。其中sigma-1受體已被克隆，與其他受體沒有同源性，廣泛分布于哺乳動物腦中，與學習和記憶、精神分裂癥、心理渴求和覓藥行為以及藥物介導的行為敏化等過程關系密切。

2、
　　 我們課題組進行的另一項研究表明：sigma-1受體促進谷氨酸釋放的效應或許是由D1受體介導的。為了進一步研究sigma-1受體是如何協(xié)同D1受體及其相互作用的環(huán)節(jié)，本文擬用突觸小體(synaptosomes)作為研究突觸末梢突觸前部分的模型，同時采用生物化學方法結合藥理學手段觀察sigma-1受體和D1受體相互作用及其作用機制。結果表明：(1)前額葉皮層突觸前sigma-1受體激動劑PRE084，SKF10047能夠放大

3、D1受體激動劑SKF38393激活的PKA活性增強，sigma-1受體拮抗劑BMY14802能阻斷其放大作用。同時，Western blot結果顯示前額葉皮層突觸前表達Sigma-1受體蛋白。(2)Sigma-1受體激動劑能夠放大膜可通透性cAMP類似物CPT-cAMP誘導的PKA活性增強、也能夠放大腺苷酸環(huán)化酶激動劑forskolin誘導的PKA活性增強，而對D1受體誘導的AC活性增強沒有作用，由此推測sigma-1受體激動劑通過D1

4、受體下游的cAMP放大D1受體激活的PKA活性增強，從而參與調節(jié)前額葉皮層突觸前谷氨酸釋放。(3)PKC廣譜抑制劑chelerythrine能夠阻斷sigma-1受體激動劑的放大作用，同時PKC激動劑PDBu能夠模擬sigma-1受體激動劑的放大作用。接下來又使用cPKC抑制劑rottlerin和cPKCβ抑制劑CGP53353(4μM)，結果證實sigma-1受體活化后下游的PKC，特別是cPKCβI，在放大D1受體信號的過程中起重要

5、作用。同時，Westernblot結果也證實了激活前額葉皮層突觸前sigma-1受體會引起cPKCβI膜轉位。(4)實驗中還驗證了Ca2+是否參與sigma-1受體的協(xié)同作用。結果顯示無Ca2+勻漿液及Ca2+螯合劑EGTA、電壓依賴性Ca2+通道阻斷劑cadmium，L-型Ca2+通道阻斷劑nimodipin都能夠阻斷sigma-1受體的協(xié)同作用。以上結果提示，激活前額葉皮層突觸前sigma-1受體，通過活化下游PKC，特別是cPKC

6、β I，以及L-型Ca2+通道從而增加突觸小體內Ca2+濃度，以此放大D1受體下游信號。這一研究不僅對揭示sigma-1受體和D1受體相互作用的作用機制具有重要意義，同時也對揭示sigma-1受體在腦內的功能及其作用機制提供了有力的證據，對臨床藥物的設計提供了有效的參考價值。
　　 第二部分、前額葉皮層突觸前磷脂酰肌醇(PI)偶聯(lián)的D1受體對經典型D1受體信號通路的調節(jié)及作用機制
　　 多巴胺(dopamine, DA)

7、是最重要的神經遞質之一。分子生物學的研究證明DA受體有D1, D2, D3, D4和D5 5種亞型，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體。除了由Gαs介導的D1受體的PKA途徑(經典D1受體途徑，D1 receptor/cAMP/PKA pathway )D1受體還可以調節(jié)PLC/IP3信號通路的活性。與經典型D1受體(D1receptor/cAMP/PKA)不同，這型受體被稱為磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)偶聯(lián)的D1受體

8、。文獻報道，磷脂酰肌醇偶聯(lián)的D1受體激動劑SKF83959激活磷脂酰肌醇偶聯(lián)的D1受體的同時對經典D1受體途徑激活的cAMP/PKA活性有抑制作用，但PI偶聯(lián)的D1受體激動劑SKF83959是否作用于經典D1受體途徑及其相互作用的環(huán)節(jié)尚無報道，是直接作用還是間接作用都需要進一步探討。
　　 為探討這一問題，本文擬用突觸小體(synaptosomes)作為研究突觸末梢突觸前部分的模型，同時采用生物化學方法結合藥理學手段觀察PI偶聯(lián)

9、的D1受體途徑(PI-linked D1-like receptors pathway)和經典D1受體途徑相互作用及作用機制。結果顯示，(1) SKF83959單獨對PKA活性沒有影響，但是可以減弱經典型D1受體激動劑誘導的PKA活性增強，并且這種調節(jié)作用能被SKF83959下游的PLCβ阻斷劑U-73122阻斷。(2)廣譜PKC抑制劑chelerythrine, cPKC特異性抑制劑rottlerin以及cPKCα,β特異性抑制劑Go

10、6976能夠阻斷PI偶聯(lián)的D1受體途徑對經典D1受體途徑的調節(jié)作用，而PKCβⅠ,Ⅱ特異性阻斷劑CGP53353不能阻斷其調節(jié)作用，由此初步推測PI偶聯(lián)的D1受體通過激活下游的cPKCα來調節(jié)經典D1受體途徑，Western blot結果顯示SKF83959能夠使cPKCα膜轉位，激活cPKCα。(3)無Ca2+勻漿液、Ca2+螯合劑EGTA和CdkS抑制劑butyrolactone能夠阻斷PI偶聯(lián)的D1受體對經典型D1受體的調節(jié)作用，

11、并且Western blot結果顯示SKF83959能夠使突觸小體中DARPP-32蛋白Thr75位點磷酸化，而不影響Thr34位點磷酸化水平及DARPP-32蛋白表達。由此可以初步得出以下結論：SKF83959激活PI偶聯(lián)的D1受體并且通過其下游的cPKCα，Ca2+以及PP2B-Cdk5介導DARPP-32 Thr75位點磷酸化從而下調經典型D1受體激活的PKA活性增強。這一研究不僅對揭示PI偶聯(lián)的D1受體途徑(PI-linked