短期延長(zhǎng)覺(jué)醒對(duì)大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層活動(dòng)及行為的影響.pdf

1、當(dāng)今社會(huì)隨著工作節(jié)奏加快和生活壓力增大，越來(lái)越多的人不得不犧牲睡眠以獲取更多的時(shí)間進(jìn)行工作。長(zhǎng)時(shí)間的覺(jué)醒伴隨著睡眠壓力不斷上升，往往會(huì)導(dǎo)致覺(jué)醒狀態(tài)不穩(wěn)定、腦高級(jí)功能受損。前額葉皮層在工作記憶、情緒調(diào)控等許多高級(jí)功能中發(fā)揮重要作用，并且睡眠剝奪對(duì)前額葉皮層的活動(dòng)和相關(guān)功能的影響尤為顯著。揭示短期延長(zhǎng)覺(jué)醒對(duì)前額葉皮層活動(dòng)的影響，將有助于了解其在延長(zhǎng)覺(jué)醒早期的變化，為改善長(zhǎng)時(shí)間作業(yè)帶來(lái)的腦高級(jí)功能障礙提供神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 在短期

2、延長(zhǎng)覺(jué)醒過(guò)程中，大腦皮層的興奮性逐漸升高。這一變化被認(rèn)為與活動(dòng)依賴性的興奮性突觸傳遞增強(qiáng)有關(guān)。然而，神經(jīng)元對(duì)傳入刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力，也會(huì)影響到皮層的活性。有研究表明，長(zhǎng)時(shí)間睡眠剝奪會(huì)引起海馬錐體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性下降。另一方面，皮層神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性具有與突觸傳遞類似的活動(dòng)依賴性增強(qiáng)的特點(diǎn)。但是目前尚不清楚短期延長(zhǎng)覺(jué)醒后，皮層神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性會(huì)發(fā)生怎樣的變化。
　　 前額葉皮層廣泛接受來(lái)自皮層下覺(jué)醒系統(tǒng)的支配。其中，外側(cè)下

3、丘腦的orexin和背縫核的5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)對(duì)于覺(jué)醒狀態(tài)下維持前額葉皮層的興奮性、調(diào)控其正常功能具有重要意義。據(jù)文獻(xiàn)顯示，大鼠在經(jīng)歷應(yīng)激后，前額葉皮層5層錐體神經(jīng)元對(duì)orexin和5-HT的反應(yīng)減弱，給與這些遞質(zhì)所誘發(fā)的興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current，EPSC)顯著減少。此外，延長(zhǎng)覺(jué)醒2h后，orexin不能有效激活藍(lán)斑和結(jié)節(jié)乳頭體核，導(dǎo)致刺

4、激orexin神經(jīng)元所引起的促覺(jué)醒效應(yīng)減弱。然而，在短期延長(zhǎng)覺(jué)醒下，前額葉皮層神經(jīng)元對(duì)促覺(jué)醒遞質(zhì)的反應(yīng)性會(huì)不會(huì)發(fā)生變化，尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)免疫組化觀察c-Fos蛋白表達(dá)，以驗(yàn)證延長(zhǎng)覺(jué)醒4h對(duì)大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層活性的影響。接下來(lái)采用離體腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，觀察延長(zhǎng)覺(jué)醒4h后，內(nèi)側(cè)前額葉皮層5層錐體神經(jīng)元的興奮性突觸傳入、內(nèi)在興奮性以及對(duì)orexin和5-HT的反應(yīng)情況，并對(duì)內(nèi)在興奮性變化的機(jī)制進(jìn)行了探討。然后

5、，運(yùn)用行為學(xué)方法，檢測(cè)了短期延長(zhǎng)覺(jué)醒對(duì)大鼠前額葉相關(guān)功能的影響，以尋找神經(jīng)元活性變化與整體功能之間的聯(lián)系。主要結(jié)果如下：
　　 1.延長(zhǎng)覺(jué)醒4h后內(nèi)側(cè)前額葉皮層c-Fos蛋白表達(dá)增多
　　 采用免疫組化對(duì)c-Fos蛋白染色顯示，延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層的c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞為286.85±11.18/mm2(n=5)，顯著高于對(duì)照組221.86±16.64/mm2(n=5，p<0.05)，提示內(nèi)側(cè)前額葉皮層活性升高。<

6、br>　　 2.延長(zhǎng)覺(jué)醒4h后內(nèi)側(cè)前額葉皮層神經(jīng)元興奮性突觸傳入增強(qiáng)
　　 在灌流液中加入GABAA受體阻斷劑picrotoxin(100μM)，記錄大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層5層錐體神經(jīng)元的EPSC。延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠神經(jīng)元(n=9)的EPSC的平均幅度為13.98±0.14pA，平均頻率為1.86±0.19Hz，與對(duì)照組大鼠神經(jīng)元(n=9)的平均幅度11.28±0.13pA和平均頻率0.98±0.09Hz相比，均顯著增加(p<0.01

7、)，提示延長(zhǎng)覺(jué)醒后神經(jīng)元的興奮性傳入增強(qiáng)。
　　 3.延長(zhǎng)覺(jué)醒4h后內(nèi)側(cè)前額葉皮層神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性增高
　　 比較對(duì)照、延長(zhǎng)覺(jué)醒組和恢復(fù)睡眠組大鼠的內(nèi)側(cè)前額葉皮層5層錐體神經(jīng)元的靜息膜電位和輸入阻抗，未見(jiàn)顯著差異(n=22，23和20，p>0.05)，單個(gè)動(dòng)作電位的閾電位、基強(qiáng)度及幅度也沒(méi)有明顯差異(p>0.05)。但是在輸入從+80pA到+300pA的躍階去極化電流的條件下，延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠神經(jīng)元(n=18)產(chǎn)生的動(dòng)作

8、電位的頻率顯著高于對(duì)照組(n=18)和恢復(fù)睡眠組(n=18，p<0.05)。分別計(jì)算每個(gè)神經(jīng)元的頻率一電流曲線的起始斜率顯示，延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠神經(jīng)元的斜率為131.84±4.16，與對(duì)照組99.89±4.15和恢復(fù)組102.91±5.40相比顯著增高(p<0.01)，表明延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠神經(jīng)元對(duì)輸入刺激產(chǎn)生放電的增益效應(yīng)提高。并且，即使用谷氨酸受體阻斷劑CNQX(10μM)和APV(50μM)抑制興奮性突觸傳入，以排除背景突觸活動(dòng)對(duì)神經(jīng)元放

9、電的影響，延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠神經(jīng)元的斜率120.35±6.38(n=7)仍高于對(duì)照組91.25±9.03(n=6)和恢復(fù)組93.71±10.37(n=6，p<0.05)。
　　 通過(guò)測(cè)量+200pA去極化電流刺激下，第一個(gè)峰電位間距(interspike interval，ISI)與第十個(gè)峰電位間距的比值(ISI1st/ISI10th)，以及第一個(gè)峰電位間距與最后一個(gè)峰電位間距的比值(ISI1s/ISI1ast)，對(duì)動(dòng)作電位的頻率適

10、應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠神經(jīng)元的ISI1st/ISI10th和ISI1s/ISI1ast分別為0.40±0.04和0.35±0.04(n=18)，顯著高于對(duì)照組(0.29±0.03和0.26±0.03，n=18)與恢復(fù)組(0.29±0.03和0.24±0.02，n=18，p<0.05)，表明延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠神經(jīng)元的頻率適應(yīng)減弱。以上結(jié)果均提示延長(zhǎng)覺(jué)醒后神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性升高，而獲得恢復(fù)性睡眠后內(nèi)在興奮性可回到基礎(chǔ)水平。

11、　　 4.內(nèi)在興奮性增高與簇放電后超極化的變化有關(guān)
　　 比較三組神經(jīng)元的簇放電后超極化(post-burst afterhyperpolarization，post-burstAHP)可以看出，延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠神經(jīng)元的簇放電后AHP不管是峰值(3.05±0.23mV，n=22)或面積(1708.66±330.9mV·ms)，均顯著低于對(duì)照組(6.07±0.26mV，3085.02±290.02mV·ms，n=19)和恢復(fù)組(5

12、.61±0.26mV，3212.51±515.45mV·ms，n=15，p<0.01)。相應(yīng)的，延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠神經(jīng)元的鈣依賴的AHP電流(峰值12.84±3.24pA，面積9685.89±1983.34pA·ms，n=7)也顯著低于對(duì)照組(50.95±14.79pA，41200.98±12429.05pA·ms，n=6)和恢復(fù)組(52.86±10.78pA，40990.15±7786.88pA·ms，n=6，p<0.05)。此外，使用2

13、00μM CdCl2抑制簇放電后AHP，不但可消除三組神經(jīng)元在簇放電后AHP上的差異(對(duì)照組n=11，延長(zhǎng)覺(jué)醒組n=12，恢復(fù)組n=8，峰值和面積均p>0.05)，并且頻率-電流曲線的起始斜率也不再具有顯著差異(對(duì)照組n=7，延長(zhǎng)覺(jué)醒組n=7，恢復(fù)組n=8，p>0.05)。以上結(jié)果提示，延長(zhǎng)覺(jué)醒后神經(jīng)元的簇放電后AHP降低，這一變化可能導(dǎo)致了內(nèi)在興奮性增高。
　　 我們還比較了單個(gè)動(dòng)作電位后的快速AHP(fast AHP，fAH

14、P)，三組神經(jīng)元(對(duì)照組n=16，延長(zhǎng)覺(jué)醒組n=18，恢復(fù)組n=15)沒(méi)有顯著差異(p>0.05)。此外，-200pA的超極化電流誘發(fā)的電壓sag比值(對(duì)照組n=13，延長(zhǎng)覺(jué)醒組n=10，恢復(fù)組n=8)，以及-65mV到-125mV的躍階電壓誘發(fā)的超極化激活陽(yáng)離子電流(對(duì)照組n=4，延長(zhǎng)覺(jué)醒組n=5，恢復(fù)組n=6)，在三組大鼠的神經(jīng)元上也未見(jiàn)差異(p>0.05)。提示延長(zhǎng)覺(jué)醒4h條件下，fAHP和超極化激活陽(yáng)離子電流未發(fā)生變化。

15、　　 5.延長(zhǎng)覺(jué)醒4h對(duì)orexin-A和5-HT在內(nèi)側(cè)前額葉皮層神經(jīng)元效應(yīng)的影響
　　 在灌流0.5μM TTX阻斷突觸前遞質(zhì)釋放的條件下，400 nM orexin-A在對(duì)照組和延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠的內(nèi)側(cè)前額葉皮層5層錐體神經(jīng)元上引起去極化反應(yīng)的反應(yīng)率(分別為6/16和5/14)及去極化程度(分別為8.25±0.39mV和7.60±1.71mV)均未見(jiàn)顯著差異(p>0.05)。此外，在對(duì)照組和延長(zhǎng)覺(jué)醒組大鼠的神經(jīng)元上，400 n

16、M orexin-A和20μM5-HT均可引起EPSC的幅度增加(p<0.01)，時(shí)間間隔縮短(p<0.01)。給與orexin-A后，對(duì)照組神經(jīng)元的EPSC頻率增加到給藥前的147.25±8.05%(n=5)，延長(zhǎng)覺(jué)醒組神經(jīng)元的EPSC頻率增加到給藥前的138.10±6.16%(n=5)，兩組之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。加入5-HT后，對(duì)照組神經(jīng)元的EPSC頻率增加到給藥前的154.34±12.09%(n=6)，延長(zhǎng)覺(jué)醒組神經(jīng)元的

17、EPSC頻率增加到給藥前的136.06±8.29%(n=5)，兩組之間也無(wú)明顯差異(p>0.05)。提示延長(zhǎng)覺(jué)醒4h后，在所測(cè)試的指標(biāo)中，內(nèi)側(cè)前額葉皮層5層錐體神經(jīng)元對(duì)orexin-A和5-HT的反應(yīng)性沒(méi)有變化。
　　 此外，我們?cè)谡４笫笊线€觀察到orexin-A對(duì)內(nèi)側(cè)前額葉皮層2/3層錐體神經(jīng)元具有去極化效應(yīng)，該效應(yīng)在0.5μM TTX或無(wú)鈣的灌流液中仍然存在，而orexin受體1拮抗劑SB-334867(1μM)可將ore

18、xin-A引起的去極化程度降低到16.11±4.31%(n=5，p<0.01)，并且orexin受體2激動(dòng)劑[Ala11，D-Leu15]-orexin-B(400 nM和1μM)不具有與orexin-A相似的去極化效應(yīng)(n=4)。提示orexin-A直接通過(guò)內(nèi)側(cè)前額葉皮層2/3層錐體神經(jīng)元上的orexin受體1引起神經(jīng)元去極化。
　　 6.短期延長(zhǎng)覺(jué)醒對(duì)大鼠行為的影響
　　 延長(zhǎng)覺(jué)醒4h后，大鼠(n=8)的平均睡眠潛伏

19、期為489.77±73.45s，顯著低于正常水平721.21±81.67s(p<0.05)，提示困倦程度增加。在T迷宮延遲交替選擇任務(wù)中，延長(zhǎng)覺(jué)醒4h對(duì)大鼠的表現(xiàn)沒(méi)有顯著影響(n=8，p>0.05)；而延長(zhǎng)覺(jué)醒8h后，大鼠在延遲30s的任務(wù)中正確率(61.25±2.95%)顯著低于正常水平(75.00±3.27%，n=8，p<0.01)。提示本實(shí)驗(yàn)條件下，延長(zhǎng)覺(jué)醒4h后工作記憶尚未明顯受損，而延長(zhǎng)覺(jué)醒8h后工作記憶能力下降。
　　

20、 在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，延長(zhǎng)覺(jué)醒4h組大鼠(n=8)與其對(duì)照組(n=8)相比，水平穿格數(shù)明顯增加(對(duì)照組81.88±14.75，延長(zhǎng)覺(jué)醒組120.63±10.05，p<0.05)。其余指標(biāo)中，站立次數(shù)、穿中央?yún)^(qū)次數(shù)和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間略高于對(duì)照組，梳理次數(shù)略低于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異(p>0.05)。延長(zhǎng)覺(jué)醒8h組大鼠(n=8)與其對(duì)照組(n=8)相比，各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異(p>0.05)，其中水平穿格數(shù)、站立次數(shù)、穿中央?yún)^(qū)次數(shù)和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間略高