2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、目的:建立一種分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠肝星狀細(xì)胞的簡(jiǎn)便易行和高效可靠的方法,將IκBαM基因轉(zhuǎn)染入大鼠肝星狀細(xì)胞,并在其中穩(wěn)定表達(dá)。探討IκBαM表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡的影響 方法:采用肝離體膠原酶和鏈霉蛋白酶灌注消化,50×g低速離心去除肝細(xì)胞,密度梯度離心法分離HSC,采用臺(tái)盼藍(lán)染色排斥法鑒定細(xì)胞活率,Desmin加α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定HSC純度。應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將IκBαM基

2、因真核表達(dá)載體pCMV-IκBαM導(dǎo)入大鼠肝星狀細(xì)胞中,采用G418篩選途徑得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的大鼠肝星狀細(xì)胞細(xì)胞,然后通過Westernblot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后大鼠肝星狀細(xì)胞中相應(yīng)IκBαM蛋白質(zhì)表達(dá)水平來反應(yīng)。首先用不同劑量TNF-α對(duì)先前培養(yǎng)成功的IκBαM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞組進(jìn)行誘導(dǎo),并使用間接免疫熒光法和Westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB/P65蛋白的表達(dá),應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)率,然后用Annexin

3、V-FITC和PI試劑分別進(jìn)行雙標(biāo)記利用流式細(xì)胞儀對(duì)兩組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果:采用本方法,每只大鼠的HSC得率為2.53×107個(gè),細(xì)胞活率為93.8%。用desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定,HSC純度為95.8%,α-SMA鑒定為97.3%。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的大鼠肝星狀細(xì)胞中證實(shí)有pCMV-IκBαM相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。轉(zhuǎn)染IκBαM的大鼠肝星狀細(xì)胞的組NF-κB蛋白的表達(dá)明顯被抑制,轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制,兩

4、者比較有顯著性差異。轉(zhuǎn)染IκBαM的大鼠肝星狀細(xì)胞有較高的凋亡率,而未轉(zhuǎn)染IκBαM的大鼠肝星狀細(xì)胞只有少許細(xì)胞發(fā)生凋亡,兩者比較有顯著性差異。 結(jié)論:改良的大鼠HSC分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便易行,在保證純度的同時(shí),提高了得率和活率。采用Desmin聯(lián)合α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞純度,提高了鑒定的敏感性。IκBαM基因真核表達(dá)載體pCMV-IBαM成功轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞,并在細(xì)胞中得到穩(wěn)定表達(dá),為進(jìn)一步研究NF-κB和肝星狀細(xì)

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