突變的核因子抑制蛋白IκBαM在大鼠肝星狀細胞中的穩(wěn)定表達及其在TNF-α誘導的大鼠肝星狀細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：建立一種分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠肝星狀細胞的簡便易行和高效可靠的方法，將IκBαM基因轉染入大鼠肝星狀細胞，并在其中穩(wěn)定表達。探討IκBαM表達對TNF-α誘導的大鼠肝星狀細胞生長抑制和凋亡的影響 方法：采用肝離體膠原酶和鏈霉蛋白酶灌注消化，50×g低速離心去除肝細胞，密度梯度離心法分離HSC，采用臺盼藍染色排斥法鑒定細胞活率，Desmin加α-SMA免疫細胞化學染色法鑒定HSC純度。應用脂質體介導的基因轉移技術將IκBαM基

2、因真核表達載體pCMV-IκBαM導入大鼠肝星狀細胞中，采用G418篩選途徑得到穩(wěn)定轉染的大鼠肝星狀細胞細胞，然后通過Westernblot技術檢測轉染后大鼠肝星狀細胞中相應IκBαM蛋白質表達水平來反應。首先用不同劑量TNF-α對先前培養(yǎng)成功的IκBαM穩(wěn)定轉染組細胞和未轉染大鼠肝星狀細胞組進行誘導，并使用間接免疫熒光法和Westernblot方法檢測細胞中NF-κB/P65蛋白的表達，應用MTT法測定細胞生長率，然后用Annexin

3、V-FITC和PI試劑分別進行雙標記利用流式細胞儀對兩組細胞的凋亡情況進行檢測。 結果：采用本方法，每只大鼠的HSC得率為2.53×107個，細胞活率為93.8％。用desmin免疫細胞化學染色法鑒定，HSC純度為95.8％，α-SMA鑒定為97.3％。穩(wěn)定轉染的大鼠肝星狀細胞中證實有pCMV-IκBαM相應蛋白質的表達。轉染IκBαM的大鼠肝星狀細胞的組NF-κB蛋白的表達明顯被抑制，轉染組較未轉染組的細胞生長明顯受到抑制，兩

4、者比較有顯著性差異。轉染IκBαM的大鼠肝星狀細胞有較高的凋亡率，而未轉染IκBαM的大鼠肝星狀細胞只有少許細胞發(fā)生凋亡，兩者比較有顯著性差異。 結論：改良的大鼠HSC分離培養(yǎng)方法簡便易行，在保證純度的同時，提高了得率和活率。采用Desmin聯(lián)合α-SMA免疫細胞化學染色法鑒定細胞純度，提高了鑒定的敏感性。IκBαM基因真核表達載體pCMV-IBαM成功轉染大鼠肝星狀細胞，并在細胞中得到穩(wěn)定表達，為進一步研究NF-κB和肝星狀細