亞慢性砷暴露對小腦的神經毒作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　砷(Arsenic，As)是一種類金屬，以無機砷和有機砷兩種形態(tài)在自然界廣泛分布。慢性砷中毒已成為影響數(shù)百萬人健康的世界性公共衛(wèi)生問題。在砷污染地區(qū)，飲用水或地下水中砷濃度達到0.25～2.1 ppm，污染嚴重的地方砷濃度已超過3.0 ppm。孟加拉國、印度和中國是全世界受危害人口最多、病區(qū)面積最大、病情最嚴重的國家。我國飲水型砷中毒病區(qū)高砷暴露人群接近300萬，且不包括由于燃煤引起的燃煤型地方性砷中毒。
　　砷

2、暴露對健康的危害是多方面的，慢性砷中毒可致引發(fā)多器官的組織學與功能上的異常改變，包括呼吸道、消化道、肝臟、腎臟、皮膚組織、免疫系統(tǒng)以及神經系統(tǒng)。神經細胞具有不能再生的特點，與其他組織比較神經細胞對毒物的毒性作用更為敏感，因此砷暴露對神經系統(tǒng)的毒性倍受關注。一些研究報道，急慢性砷暴露兒童會出現(xiàn)與神經系統(tǒng)損傷有關后遺癥。由于腦功能受到抑制，從而導致神經組織發(fā)育障礙和智力低下，例如出現(xiàn)運動、認知、心理、感覺和語言等功能障礙。對孟加拉國砷含量偏

3、高地區(qū)進行的兩項流行病學調查顯示，兒童水砷暴露與智力降低密切相關，與染砷動物實驗結果一致。提示，砷中毒影響青少年學習記憶能力。然而，砷暴露影響學習記憶能力的機理目前尚不十分清楚。動物試驗結果表明，砷暴露可導致小鼠小腦中砷含量呈劑量依賴性增高，且損傷小腦神經元，影響小腦功能。這些結果提示，小腦可能是砷毒性作用的靶器官之一。研究顯示:小腦不僅負責調解肌張力、保持身體平衡和協(xié)調精細運動，而且參與認知功能的調節(jié)，包括學習能力、注意集中力、語言能

4、力等。上述動物試驗結果和文獻報道表明，損傷性影響小腦功能可能與砷暴露導致的學習記憶能力下降有關。有研究報道鉛、鋁、氟等暴露可導致學習記憶能力下降。而且已證實鉛、鋁、氟的神經毒性與調控學習記憶機制相關蛋白的編碼基因表達變化有關。近年來，越來越多的學者開始把小腦作為神經毒物靶器官開展研究。那么，砷的神經毒作用機制是否與小腦學習記憶相關的基因表達紊亂有關呢，引起我們極大興趣。
　　基因芯片技術因具有快速、準確、同時分析大量基因信息的特點

5、，被廣泛運用于生命科學領域。采用基因芯片技術研究在環(huán)境毒物刺激條件下的大量基因差異表達情況，可揭示神經毒性相關的分子生物機制。運用基因芯片技術分析砷暴露所致小腦基因表達譜變化，對篩選砷所致神經毒性相關基因及其探討可能機制有著重要的作用。
　　本研究采用成年小鼠進行飲水砷染毒，并觀察亞慢性砷暴露對小鼠小腦學習記憶能力的影響;采用基因芯片技術篩選出砷暴露組與對照組小鼠小腦的差異表達基因，經通路分析發(fā)現(xiàn)長時程記憶等相關通路受到影響;在篩

6、選出的差異表達基因中，發(fā)現(xiàn)突觸后致密體功能基因表達受到影響，包括離子型/膜型谷氨酸受體、IP3受體、激酶CaMKⅡ、PLCβ4等;由于這些基因在長時程記憶相關通路中起到關鍵的作用，引起我們極大興趣，我們觀察了小腦突觸后致密體超微結構，且對這些基因的表達進行驗證。并檢測突觸后致密體關鍵酶CaMKⅡ的蛋白表達水平，且對CaMKⅡ下游長時程記憶相關通路的關鍵蛋白進行檢測。為闡明砷致小腦學習記憶功能損害的分子機制以及防治砷中毒提供依據(jù)。

7、　　方法：
　　1、選用月齡為一個月的健康昆明小鼠64只，體重22.3～26.4 g，在標準動物房內飼養(yǎng)。對照組小鼠飲用滅菌自來水，實驗組小鼠分別飲用1 ppm、2 ppm和4 ppm三氧化二砷水溶液。小鼠飲用水每兩天更換一次，染毒時間為2個月。
　　2、測定腦砷含量:采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)測量方法。
　　3、HE染色觀察小腦組織形態(tài)學變化。
　　4、檢測小鼠學習記憶能力和小腦運動性學習記憶能力

8、:分別采用Moms水迷宮定向航行試驗和瞬膜條件反射試驗。
　　5、小鼠小腦組織基因芯片檢測，差異表達基因分析。
　　6、檢測亞慢性砷暴露對小鼠小腦突觸后致密體基因表達影響。采用realtime-PCR(RT-PCR)檢測小腦NMDA受體亞基NR1、AMPA受體亞基GluR1和GluR2、mGlu受體亞基mGluR1、IP3受體亞基IP3R1、激酶CaMKⅡ、PLCβ4基因表達。
　　7、透射電鏡觀察小鼠小腦組織突觸形態(tài)

9、結構的變化。
　　8、檢測小腦CaMKⅡ及下游通路關鍵蛋白表達變化。采用免疫印跡法(Western-blot)檢測小鼠小腦PSD中CaMKⅡ蛋白表達和磷酸化水平;檢測小鼠小腦組織Ras、Raf、 ERK1/2的磷酸化水平。
　　結果：
　　1、實驗期間，各組小鼠一般情況良好。隨飼養(yǎng)時間延長，小鼠體重增加。從第36天開始，4 ppm劑量組小鼠體重增幅減慢，與對照組和1 ppm染砷組相比，差異有統(tǒng)計學(P＜0.05)。這種

10、差異一直維持到實驗結束。在染毒末期，2 ppm劑量組小鼠體重增幅減慢，與對照組和1 ppm染砷組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2、各實驗組小鼠小腦砷含量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)且呈劑量依賴關系。
　　3、本研究高劑量染砷組中，小腦分子細胞層胞漿染色不均勻，纖維分布不均，細胞漿淡染，細胞皺縮。浦肯野細胞層，小腦組織浦肯野細胞層胞漿染色淡，纖維（粉染區(qū)）變大，且不均勻，細胞胞漿淡染，胞核

11、皺縮;顆粒細胞層細胞數(shù)量減少。
　　4、亞慢性砷暴露對小鼠運動性學習記憶能力的影響
　　Morris水迷宮結果:對小鼠采用As2O3染毒60天后，與對照組比較:2 ppm和4 ppm As2O3染毒組小鼠的逃避潛伏期顯著增長(P＜0.05)，并且逃避潛伏期隨著染毒劑量的增加而增長。
　　瞬膜條件反射結果提示:As2O3染毒60天后，4 ppm As2O3染毒小鼠的瞬膜條件反射與對照組比較呈顯著降低(P＜0.05)。

12、r>　　5、基因芯片結果顯示，與對照組小鼠小腦基因表達譜比較，4 ppm染砷組顯示1597個差異表達基因，其中1046個表達下調，551個表達上調。GO分析提示，突觸后致密體上蛋白編碼基因的表達有顯著性差異，KEGG通路分析LTP和LTD為有顯著性差異（且P值最?。┑耐?。位于突觸后致密體并參與LTP/LTD的基因為:CaMKⅡ、Gria1、Gria2、Grin1、Itpr1、Grm1、PLCβ4基因。
　　6、與基因芯片結果一致

13、，CaMKⅡ、Gria1、Gria2、Grin1、Itpr1、Grm1、PLCβ4的mRNA表達下降。
　　7、透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，As2O3染毒60天后，2 ppm和4 ppm As2O3染毒小鼠的突觸后致密體厚度與對照組比較顯著變薄(P＜0.05)。
　　8、亞慢性砷暴露后，小鼠小腦CaMKⅡ蛋白表達及磷酸化狀態(tài)蛋白表達都下降(P＜0.05)，磷酸化Raf、ERK1/2蛋白表達下降(P＜0.05)。
　　結論：

14、>　　1、亞慢性砷暴露后，砷在小鼠腦組織中蓄積，呈劑量反應關系。
　　2、亞慢性砷暴露導致小腦組織形態(tài)學異常改變，亞慢性砷暴露損害學習記憶功能。
　　3、亞慢性砷暴露干擾小腦學習記憶功能相關基因表達。
　　4、亞慢性砷暴露使小鼠小腦PSD功能基因NR1、Gria1、Gria2、mGluR1、Itpr1、PLCβ4、CaMKⅡ表達顯著異常;導致小腦組織PSD厚度改變。
　　5、亞慢性砷暴露抑制小鼠小腦CaMKⅡ及其