穩(wěn)定表達(dá)長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽-1重組釀酒酵母的構(gòu)建及其應(yīng)用研究.pdf

1、由于腸道內(nèi)吸收不充分,目前大多數(shù)肽類及蛋白質(zhì)藥物仍然通過(guò)非腸道途徑給藥。治療用肽類和蛋白質(zhì)通常用于治療慢性疾病,長(zhǎng)期注射給藥會(huì)產(chǎn)生明顯的不良結(jié)果。相對(duì)于這種不方便且存在潛在問(wèn)題的給藥方法,口服途徑具有患者自我給藥優(yōu)勢(shì),可大大提高患者接受性和依從性,同時(shí)可避免注射給藥帶來(lái)的疼痛、不適和感染的可能。因此,開(kāi)發(fā)有效而成功的口服給藥系統(tǒng)以使這類藥物發(fā)揮最大治療潛力成為制藥研究的一個(gè)重要課題。將表達(dá)肽類和蛋白藥物的重組微生物用作藥物釋放系統(tǒng)是一個(gè)

2、創(chuàng)新性的途徑。細(xì)菌和酵母都可成為胃腸道中釋放藥物的新型載體。
　　 胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)稱為腸促胰島素,是一種分泌自腸道細(xì)胞的肽激素,具有血糖依賴性促胰島素分泌、刺激β-細(xì)胞增殖等多種生理功能。在2型糖尿病的臨床治療中具有較好的應(yīng)用前景。但由于體內(nèi)二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)的快速降解和腎臟代謝作用,導(dǎo)致其半衰期很短,使其臨床應(yīng)用受到了很大限制。因而,開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效藥用GLP

3、-1類似物已成為受關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　 釀酒酵母(面包酵母)本身富含維生素、消化酶等,我國(guó)臺(tái)灣、香港等地素有飲用酵母茶或酵母飲料的悠久歷史。若使其胞內(nèi)再能穩(wěn)定表達(dá)多肽類糖尿病治療藥物,以釀酒酵母細(xì)胞作為藥物載體一緩釋"膠囊",研發(fā)治療性功能酵母飲品、食品或生物藥物,使人們?cè)谄穱L美味飲品或食品的同時(shí),起到預(yù)防和治療糖尿病等慢性疾病的作用,前景十分誘人。
　　 本研究旨在構(gòu)建一種胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)多肽類糖尿病治療藥物的釀酒酵母,

4、為研發(fā)治療性功能酵母飲品、食品或生物藥物奠定基礎(chǔ)。首先從構(gòu)建以質(zhì)粒pUC18作為骨架的整合型載體入手,以釀酒酵母染色體中多拷貝串聯(lián)排列的rDNA序列作為外源基因多拷貝整合的位點(diǎn),設(shè)計(jì)兩對(duì)引物擴(kuò)增rDNA序列中位于25S和5S rDNA之間的一段2.2kb的同源重組熱點(diǎn)區(qū)域,得到AB和CD兩條rDNA片段。將AB、CD分別連接到pUC18的SacI/EcoRI和PstI位點(diǎn),得到pUC18-Sr。以質(zhì)粒pYX212作為模板,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物U

5、1/U2和T1/T1,分別擴(kuò)增得到營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因URA3和包括組成型磷酸丙糖異構(gòu)酶(triose-phosphate isomerase,TPI)啟動(dòng)子在內(nèi)的表達(dá)盒(TPI cassette)片段,將URA3基因和表達(dá)盒依次連接到pUC18-Sr的SalI/XbaI和XbaI/KpnI位點(diǎn),得到載體pNK1。此外,將表達(dá)盒和來(lái)自于質(zhì)粒pYEX的選擇標(biāo)記Leu2-d基因片段依次連入載體pUC18-Sr的XbaI/Kpn1。和平端化的XbaI

6、位點(diǎn),得到載體pNK2。
　　 為檢驗(yàn)載體pNK1和pNK2的功能,將來(lái)自質(zhì)粒pEGFP-N1的綠色熒光蛋白基因(GFP)的BamHI/KpaI片段連接到pNK1和pNK2的BamHI/XmaI位點(diǎn),構(gòu)建表達(dá)載體pNK1-GFP和pNK2-GFP。將兩個(gè)載體線性化后轉(zhuǎn)化釀酒酵母,在Ura和Leu選擇培養(yǎng)基可以篩選到相應(yīng)載體的酵母轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明選擇標(biāo)記基因功能正常。通過(guò)熒光顯微鏡能夠觀察到過(guò)夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子有綠色熒光,表明TPI啟

7、動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白基因表達(dá)。此外,利用Southern blot證明了GFP基因能夠整合到酵母染色體中。在非選擇性壓力下,轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)近50代培養(yǎng)后,分別有99％的含有URA3基因的轉(zhuǎn)化子和100%含有Leu-2d基因的轉(zhuǎn)化子仍然能夠在各自的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。表明兩種整合載體都能夠保證整合于酵母的染色體中的GFP基因的遺傳穩(wěn)定性。在細(xì)胞濃度相同條件下,通過(guò)熒光顯微鏡觀察到含有pNK-1-GFP的轉(zhuǎn)化子中有58%的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。故

8、選擇pNK1來(lái)進(jìn)行人的重組胰高血糖素樣肽-1類似物的表達(dá)。
　　 以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的十拷貝長(zhǎng)效口服GLP-1(recombinant oval long-actingGLP-1,rolGLP-1)融合基因作為外源基因,利用多拷貝釀酒酵母整合載體pNK1構(gòu)建表達(dá)載體pNK-GLP。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化蛋白酶缺陷型釀酒酵母BJ2407,通過(guò)Ura營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取三個(gè)轉(zhuǎn)化子,經(jīng)過(guò)Southern blot鑒定和生長(zhǎng)活力測(cè)定,

9、選擇轉(zhuǎn)化子SG2用于進(jìn)一步研究。小量培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子SG2經(jīng)過(guò)玻璃珠破碎,SDS-PAGE后,利用Western blot檢測(cè)到一條約36kDa的蛋白條帶,大小與預(yù)期相符,表明rolGLP-1融合蛋白得到表達(dá)。經(jīng)過(guò)1:1接種培養(yǎng)的SG2裂解后,用Ni-NTA分離rolGLP-1融合蛋白。根據(jù)Bradford定量法和蛋白光密度分析算出rolGLP-1融合蛋白表達(dá)量的估計(jì)值為0.84mg/g濕細(xì)胞。在非選擇培養(yǎng)基中的連續(xù)培養(yǎng)和Western b

10、lot鑒定表明,SG2中的rolGLP-1融合基因保持著良好的穩(wěn)定性。利用冷凍干燥技術(shù)處理培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期末的SG2,用凍干的SG2進(jìn)行降低高血糖大鼠血糖水平的研究。
　　 Wistar大鼠禁食10小時(shí)后,腹腔注射60mg/kg鏈脲佐菌素構(gòu)建高血糖模型大鼠。造模成功的大鼠血糖水平為25.1±3.5mM。對(duì)高血糖大鼠分別進(jìn)行5g重組酵母SG2/kg劑量灌胃;0.5 g重組酵母SG2/kg劑量灌胃和0.1 g重組酵母SG2/kg劑量灌胃

11、;陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行0.1g二甲雙胍/kg劑量灌胃;模型組進(jìn)行5g酵母BJ2407/kg劑量灌胃,所有處理持續(xù)20天。體內(nèi)活性分析結(jié)果表明,模型組大鼠血糖依然維持高水平(26.2±2.9mM)。0.5 g重組酵母SG2/kg和0.1g重組酵母SG2/kg處理組大鼠血糖水平?jīng)]有明顯降低。0.1g二甲雙胍/kg和5g重組酵母SG2/kg服藥量能夠顯著降低高血糖大鼠血糖水平。二甲雙胍組大鼠血糖值由灌胃前的25.1±3.9mM下降到19.1±4.3

12、mM;5g重組酵母SG2/kg處理組大鼠血糖水平由24.8±1:4.0mM下降到21.2±3.8mM。此外,大鼠飲水量、攝食量和體重等異常體征也明顯改善。
　　 綜上所述,本研究以rDNA序列為整合位點(diǎn)分別構(gòu)建了含有不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記和相同組成型啟動(dòng)子的多拷貝整合載體pNK1和pNK2,并以載體pNKl構(gòu)建了含有十拷貝長(zhǎng)效rolGLP-1融合基因的表達(dá)載體,通過(guò)轉(zhuǎn)化釀酒酵母BJ2407得到穩(wěn)定表達(dá)長(zhǎng)效rolGJLP-1融合蛋