穩(wěn)定表達長效胰高血糖素樣肽-1重組釀酒酵母的構建及其應用研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩183頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、由于腸道內(nèi)吸收不充分,目前大多數(shù)肽類及蛋白質(zhì)藥物仍然通過非腸道途徑給藥。治療用肽類和蛋白質(zhì)通常用于治療慢性疾病,長期注射給藥會產(chǎn)生明顯的不良結果。相對于這種不方便且存在潛在問題的給藥方法,口服途徑具有患者自我給藥優(yōu)勢,可大大提高患者接受性和依從性,同時可避免注射給藥帶來的疼痛、不適和感染的可能。因此,開發(fā)有效而成功的口服給藥系統(tǒng)以使這類藥物發(fā)揮最大治療潛力成為制藥研究的一個重要課題。將表達肽類和蛋白藥物的重組微生物用作藥物釋放系統(tǒng)是一個

2、創(chuàng)新性的途徑。細菌和酵母都可成為胃腸道中釋放藥物的新型載體。
   胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)稱為腸促胰島素,是一種分泌自腸道細胞的肽激素,具有血糖依賴性促胰島素分泌、刺激β-細胞增殖等多種生理功能。在2型糖尿病的臨床治療中具有較好的應用前景。但由于體內(nèi)二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)的快速降解和腎臟代謝作用,導致其半衰期很短,使其臨床應用受到了很大限制。因而,開發(fā)長效藥用GLP

3、-1類似物已成為受關注的一個熱點。
   釀酒酵母(面包酵母)本身富含維生素、消化酶等,我國臺灣、香港等地素有飲用酵母茶或酵母飲料的悠久歷史。若使其胞內(nèi)再能穩(wěn)定表達多肽類糖尿病治療藥物,以釀酒酵母細胞作為藥物載體一緩釋"膠囊",研發(fā)治療性功能酵母飲品、食品或生物藥物,使人們在品嘗美味飲品或食品的同時,起到預防和治療糖尿病等慢性疾病的作用,前景十分誘人。
   本研究旨在構建一種胞內(nèi)穩(wěn)定表達多肽類糖尿病治療藥物的釀酒酵母,

4、為研發(fā)治療性功能酵母飲品、食品或生物藥物奠定基礎。首先從構建以質(zhì)粒pUC18作為骨架的整合型載體入手,以釀酒酵母染色體中多拷貝串聯(lián)排列的rDNA序列作為外源基因多拷貝整合的位點,設計兩對引物擴增rDNA序列中位于25S和5S rDNA之間的一段2.2kb的同源重組熱點區(qū)域,得到AB和CD兩條rDNA片段。將AB、CD分別連接到pUC18的SacI/EcoRI和PstI位點,得到pUC18-Sr。以質(zhì)粒pYX212作為模板,設計兩對引物U

5、1/U2和T1/T1,分別擴增得到營養(yǎng)標記基因URA3和包括組成型磷酸丙糖異構酶(triose-phosphate isomerase,TPI)啟動子在內(nèi)的表達盒(TPI cassette)片段,將URA3基因和表達盒依次連接到pUC18-Sr的SalI/XbaI和XbaI/KpnI位點,得到載體pNK1。此外,將表達盒和來自于質(zhì)粒pYEX的選擇標記Leu2-d基因片段依次連入載體pUC18-Sr的XbaI/Kpn1。和平端化的XbaI

6、位點,得到載體pNK2。
   為檢驗載體pNK1和pNK2的功能,將來自質(zhì)粒pEGFP-N1的綠色熒光蛋白基因(GFP)的BamHI/KpaI片段連接到pNK1和pNK2的BamHI/XmaI位點,構建表達載體pNK1-GFP和pNK2-GFP。將兩個載體線性化后轉化釀酒酵母,在Ura和Leu選擇培養(yǎng)基可以篩選到相應載體的酵母轉化子。結果表明選擇標記基因功能正常。通過熒光顯微鏡能夠觀察到過夜培養(yǎng)的轉化子有綠色熒光,表明TPI啟

7、動子能夠驅動綠色熒光蛋白基因表達。此外,利用Southern blot證明了GFP基因能夠整合到酵母染色體中。在非選擇性壓力下,轉化子經(jīng)過近50代培養(yǎng)后,分別有99%的含有URA3基因的轉化子和100%含有Leu-2d基因的轉化子仍然能夠在各自的選擇培養(yǎng)基上生長。表明兩種整合載體都能夠保證整合于酵母的染色體中的GFP基因的遺傳穩(wěn)定性。在細胞濃度相同條件下,通過熒光顯微鏡觀察到含有pNK-1-GFP的轉化子中有58%的細胞發(fā)出綠色熒光。故

8、選擇pNK1來進行人的重組胰高血糖素樣肽-1類似物的表達。
   以本實驗室構建的十拷貝長效口服GLP-1(recombinant oval long-actingGLP-1,rolGLP-1)融合基因作為外源基因,利用多拷貝釀酒酵母整合載體pNK1構建表達載體pNK-GLP。用表達載體轉化蛋白酶缺陷型釀酒酵母BJ2407,通過Ura營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選轉化子。隨機挑取三個轉化子,經(jīng)過Southern blot鑒定和生長活力測定,

9、選擇轉化子SG2用于進一步研究。小量培養(yǎng)的轉化子SG2經(jīng)過玻璃珠破碎,SDS-PAGE后,利用Western blot檢測到一條約36kDa的蛋白條帶,大小與預期相符,表明rolGLP-1融合蛋白得到表達。經(jīng)過1:1接種培養(yǎng)的SG2裂解后,用Ni-NTA分離rolGLP-1融合蛋白。根據(jù)Bradford定量法和蛋白光密度分析算出rolGLP-1融合蛋白表達量的估計值為0.84mg/g濕細胞。在非選擇培養(yǎng)基中的連續(xù)培養(yǎng)和Western b

10、lot鑒定表明,SG2中的rolGLP-1融合基因保持著良好的穩(wěn)定性。利用冷凍干燥技術處理培養(yǎng)至對數(shù)期末的SG2,用凍干的SG2進行降低高血糖大鼠血糖水平的研究。
   Wistar大鼠禁食10小時后,腹腔注射60mg/kg鏈脲佐菌素構建高血糖模型大鼠。造模成功的大鼠血糖水平為25.1±3.5mM。對高血糖大鼠分別進行5g重組酵母SG2/kg劑量灌胃;0.5 g重組酵母SG2/kg劑量灌胃和0.1 g重組酵母SG2/kg劑量灌胃

11、;陽性對照組進行0.1g二甲雙胍/kg劑量灌胃;模型組進行5g酵母BJ2407/kg劑量灌胃,所有處理持續(xù)20天。體內(nèi)活性分析結果表明,模型組大鼠血糖依然維持高水平(26.2±2.9mM)。0.5 g重組酵母SG2/kg和0.1g重組酵母SG2/kg處理組大鼠血糖水平?jīng)]有明顯降低。0.1g二甲雙胍/kg和5g重組酵母SG2/kg服藥量能夠顯著降低高血糖大鼠血糖水平。二甲雙胍組大鼠血糖值由灌胃前的25.1±3.9mM下降到19.1±4.3

12、mM;5g重組酵母SG2/kg處理組大鼠血糖水平由24.8±1:4.0mM下降到21.2±3.8mM。此外,大鼠飲水量、攝食量和體重等異常體征也明顯改善。
   綜上所述,本研究以rDNA序列為整合位點分別構建了含有不同營養(yǎng)缺陷型選擇標記和相同組成型啟動子的多拷貝整合載體pNK1和pNK2,并以載體pNKl構建了含有十拷貝長效rolGLP-1融合基因的表達載體,通過轉化釀酒酵母BJ2407得到穩(wěn)定表達長效rolGJLP-1融合蛋

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論