可解離的人胰高血糖素樣肽-1與人血清白蛋白融合蛋白的初步研究.pdf

1、胰高血糖素樣肽-1是在腸L細(xì)胞中分泌的一種由30個氨基酸殘基組成的功能短肽。它具有葡萄糖依賴性的促進(jìn)胰島素分泌、減慢胃的排空、減少食物攝取、以及抑制胰高血糖素的分泌、刺激胰島B細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡等多種功能。GLP-1通過與胰島B細(xì)胞上的GLP-1受體相結(jié)合，使后者以葡萄糖依賴的方式分泌胰島素。Ⅱ型糖尿病人常常表現(xiàn)為GLP-1分泌受損，而人體胰島B細(xì)胞對GLP-1的反應(yīng)往往是正常的，因此GLP-1在治療Ⅱ型糖尿病方面具有良好的應(yīng)用前景

2、。但是，機(jī)體本身產(chǎn)生的有活性的GLP-1很容易被二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解而失去活性，同時很容易從腎臟排出體外，故其生物半衰期僅為2～6min，這在很大程度上限制了其臨床應(yīng)用與療效。
　　小分子蛋白類藥物的長效化改造通常是將其與具有較長半衰期的人血清白蛋白或聚乙二醇相結(jié)合。然而由于HSA的空間位阻效應(yīng)，傳統(tǒng)的人血清白蛋白融合技術(shù)在改善藥代動力學(xué)性質(zhì)的同時往往伴隨著藥效動力學(xué)）性質(zhì)的下降。本項(xiàng)研究中通過在GLP-1和HSA之間

3、插入能夠被弗林蛋白酶（furin）切割的多肽序列，使得GLP-1在體內(nèi)以可控和靶向的方式被釋放，同時將其序列中的第二位Ala替換為Gly，阻止DPP-Ⅳ的降解，恢復(fù)其生物學(xué)活性，從而在藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)性質(zhì)之間達(dá)到平衡，使其發(fā)揮最大療效。
　　本研究的目標(biāo)在于構(gòu)建四種在體內(nèi)以不同速率解離的人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)與人血清白蛋白融合蛋白，進(jìn)一步考察各種融合蛋白的療效與其解離速率之間的關(guān)系，獲得在藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)之

4、間保持最佳平衡的融合蛋白。所用到的方法及結(jié)論主要有:
　　1、通過多步PCR擴(kuò)增出具有不同解離速率的融合蛋白的全部基因，將其克隆到表達(dá)載體pPIC9，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115，經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)，分泌表達(dá)各種GLP-1與HSA融合蛋白，并將各種融合蛋白分離純化后進(jìn)行初步藥代學(xué)和藥效學(xué)研究。
　　2、通過將各種融合蛋白樣品與furin共同孵育后，其酶切產(chǎn)物用Western印跡法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，不可解離的融合蛋白在furin的作

5、用下未發(fā)生解離，而可解離的融合蛋白Gly2-GLP-1-VTR-HSA為慢解離，Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA為中等速率解離，Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA為快解離。
　　3、通過在不同濃度的葡萄糖環(huán)境下，用各種融合蛋白刺激MIN6細(xì)胞分泌胰島素，檢測分泌量的變化方法來確定各融合蛋白的體外生物學(xué)活性。結(jié)果表明，在高糖(25mM)和低糖(0.5mM)環(huán)境下，Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA，G

6、ly2-GLP-1-VTR-HSA,Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA和Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA組胰島素釋放量均高于空白對照組，差異極顯著;而融合蛋白之間的胰島素釋放量無顯著性差異。
　　4、通過皮下注射100μg的各種融合蛋白，于不同時間點(diǎn)通過尾靜脈取血，利用雙抗體夾心法Elisa進(jìn)行檢測血清中融合蛋白的濃度來確定各種融合蛋白的藥代動力學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明各種融合蛋白在體內(nèi)的半衰期大小依次為Gly2

7、-GLP-1-GGGGG-HSA、Gly2-GLP-1-VTR-HSA、Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA、Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA。
　　5、將實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔單獨(dú)注射葡萄糖后，立即皮下注射生理鹽水和不同融合蛋白的(40nmol/kg)供試樣品。于不同時間點(diǎn)取血，測定血糖濃度來評價各種融合蛋白的體內(nèi)藥效動力學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明各種融合蛋白均表現(xiàn)出降糖活性，且其活性高低依次為Gly2-GLP-1-VTR-

8、HSA、Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA、Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA、Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA。
　　本研究中引入蛋白酶切割位點(diǎn)后，GLP-1可以在體內(nèi)從融合蛋白中解離出來，使其恢復(fù)生物學(xué)活性。只有控制融合蛋白在體內(nèi)適當(dāng)?shù)慕怆x速率才能達(dá)到最佳的療效，從而在藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)性質(zhì)之間達(dá)到平衡。本項(xiàng)研究利用可解離的人血清白蛋白融合技術(shù)將為長效蛋白藥物開發(fā)中面臨的藥效動力學(xué)和藥代動力