油菜開花時(shí)間變異分析和擬南芥晚開花突變體鑒定與基因克隆.pdf

1、本研究包括油菜開花時(shí)間變異與AFLP分析，擬南芥T-DNA插入突變體的篩選與晚開花基因克隆。全文分為兩部分：　　第一部分：油菜開花時(shí)間變異分析。 在2003～2005兩年間利用已培育的78份油菜開花時(shí)間變異廣泛的品系(甘藍(lán)型油菜70份，白菜型油菜4份和芥菜型油菜4份)，于武漢和西寧兩地秋播和夏播，觀察油菜開花時(shí)間變化規(guī)律，并利用AFLP技術(shù)檢測(cè)了油菜開花時(shí)間變異的分子多態(tài)性。獲得的結(jié)果如下： 1、78份油菜材料在武漢兩

2、年秋播的開花時(shí)間變化極顯著，兩年夏播的開花時(shí)間變化不顯著。通過分析日平均氣溫、積溫、日照時(shí)數(shù)和日照總時(shí)數(shù)等環(huán)境影響因子，發(fā)現(xiàn)武漢兩年秋播開花時(shí)間差異大的原因是兩年的氣溫差異較大所致。 2、通徑分析發(fā)現(xiàn)武漢秋播條件下從播種到開花期油菜所需積溫差異是導(dǎo)致開花時(shí)間變異的主要原因，其它環(huán)境因子是通過積溫而影響開花的。 3、選取22對(duì)選擇性引物組合對(duì)78份油菜品系進(jìn)行了AFLP分析。一共擴(kuò)增出1323條擴(kuò)增帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增53

3、條帶。經(jīng)方差分析，得到137條與兩年兩地油菜開花時(shí)間都相關(guān)的AFLP條帶。經(jīng)聚類分析，將78份油菜分成5類：第1類是1～2月上旬開花的材料；第2類僅1份材料，表現(xiàn)特殊；第3類為2月中旬開花的材料；第4類是2月中下旬到3月上旬開花的材料；第5類為3～4月份開花的材料，全為白菜型和芥菜型油菜。 第二部分:篩選擬南芥突變體，鑒定克隆開花時(shí)間突變的基因。所篩選的擬南芥突變體庫系用IGDB-XVE-Tagging載體系統(tǒng)構(gòu)建的T-DNA插

4、入突變體(野生型為Col-0生態(tài)型)。擬南芥突變體植株的篩選在人工生長(zhǎng)室內(nèi)進(jìn)行，共篩選觀察了51660個(gè)T3代突變體單株，發(fā)現(xiàn)了4株晚開花突變體表型，并且為PCR陽性。對(duì)其中一個(gè)株系A(chǔ)T2-4的進(jìn)一步研究結(jié)果如下： 1、株系A(chǔ)T2-4從播種到開花的天數(shù)變幅為34～72天，平均為51天，野生型的變幅為30～33天，平均為32天。southern雜交結(jié)果表明，其T-DNA為單拷貝插入，因此推斷該插入功能失活突變體株系的上代單株為雜合

5、體，且為一個(gè)插入突變位點(diǎn)。 2、利用TAIL-PCR方法克隆了該晚開花突變體的插入位點(diǎn)基因的側(cè)翼序列。將這個(gè)片段回收、測(cè)序、去掉載體序列后得到擬南芥基因組中T-DNA插入左側(cè)側(cè)翼序列，長(zhǎng)度是798bp。 4、通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)T-DNA是插入到AT5G24290基因中，該798bp的側(cè)翼序列和AT5G24290基因?qū)?yīng)序列相似性為100％。沒有發(fā)現(xiàn)序列有對(duì)應(yīng)的并經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究的功能，僅發(fā)現(xiàn)該插入功能失活的AT5G24