HPV16感染及宮頸病變與CALCA基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系研究.pdf

1、目的：以往研究報(bào)道宮頸癌組織中降鈣素基因相關(guān)肽基因（calcitonin-related peptide，CALCA)的啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化，并提示其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)或蛋白質(zhì)表達(dá)缺失。人乳頭瘤病毒16（HPV16）持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要因素，但是對CALCA基因表達(dá)水平的影響機(jī)制尚未查證。本課題擬利用維吾爾族婦女宮頸癌標(biāo)本資源，研究宮頸病變病理進(jìn)程與CALCA蛋白表達(dá)水平變化的關(guān)系，同時選擇HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞和RNAi技術(shù)，研

2、究CALCA基因甲基化對HPV16-E7致癌蛋白表達(dá)的依存關(guān)系。
　　 方法：（1）選擇HPV16-E7基因特異的siRNA片段，構(gòu)建慢病毒siRNA重組表達(dá)載體，經(jīng)293FT病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒，并以此感染HPV16陽性SiHa宮頸癌細(xì)胞、抗菌素篩選和分子生物學(xué)鑒定，建立穩(wěn)定表達(dá)HPV16E7-siRNA的RNAi細(xì)胞模型。（2）以SiHa細(xì)胞和RNAi細(xì)胞模型的基因組DNA，選擇CALCA基因啟動子區(qū)富含CpG島嶼的

3、目標(biāo)片段，經(jīng)引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、克隆與測序，研究RNAi抑制HPV16-E7表達(dá)后，CALCA基因甲基化狀態(tài)的可逆性程度。（3）收集維吾爾族婦女宮頸炎、低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（HSIL）和鱗癌（CSCC）患者的石蠟包埋組織標(biāo)本104例，采用免疫組織化學(xué)法鑒定CALCA基因的蛋白表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果：（1）成功地建立了穩(wěn)定表達(dá)HPV16-E7-siRNA片段的RNAi細(xì)胞模型，對目標(biāo)基因（E7）

4、表達(dá)的抑制效率，也以蛋白免疫印跡和RT-PCR確證。（2）選出CALCA基因啟動子區(qū)富含CpG位點(diǎn)的目標(biāo)片段，其大小為365堿基，含有19個CpG島嶼，發(fā)現(xiàn)其中13個CpG位點(diǎn)的胞嘧啶在SiHa細(xì)胞基因組DNA中發(fā)生了甲基化（13/19），而在表達(dá)HPV16-E7-siRNA的RNAi細(xì)胞模型中，所有CpG位點(diǎn)的甲基化已發(fā)生逆轉(zhuǎn)（0/19位點(diǎn)），同時RNAi干預(yù)后，CALCA基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，蛋白質(zhì)表達(dá)水平增高，證明該該目標(biāo)片段的甲基化對

5、HPV16-E7致癌蛋白表達(dá)存在依賴關(guān)系，而且甲基化對該基因表達(dá)產(chǎn)生了抑制效應(yīng)。（3）臨床標(biāo)本研究顯示，隨著宮頸病變程度加重，CALCA蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)從強(qiáng)表達(dá)到弱表達(dá)缺失或表達(dá)缺失的改變，其宮頸炎、LSIL、HSIL和CSCC患者各組的CALCA蛋白“表達(dá)缺失率”分別為45.5%（15/33）、75%（12/16）、80.8%（21/26）和82.8%（24/29）,與宮頸病變進(jìn)程呈負(fù)相關(guān)（r=-0.361，P<0.01）。