宮頸病變中RASSF1A基因微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、錯配修復(fù)基因表達及HPV16感染狀況的研究.pdf

1、目的：新近克隆出來的Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因(RASSF1A)已被確認為一種候選抑癌基因(TSGs)，位于人類染色體3p21.3上。RASSF1A基因失表達見于多種人類腫瘤中。微衛(wèi)星變異(MSI microsatellite alteration)是導(dǎo)致RASSF1A基因失活的重要機制，其參與了細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、微管的穩(wěn)定作用和有絲分裂的進程，作為一種Ras負相調(diào)節(jié)因子阻止細胞生長，誘導(dǎo)細胞凋亡，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。 微衛(wèi)

2、星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)是指在復(fù)制過程中由于錯配修復(fù)基因突變而引起的DNA基因組中簡單重復(fù)序列的增加或丟失，也稱為復(fù)制錯誤陽性或復(fù)制錯誤表型。目前人類的錯配修復(fù)酶(mismatch repair enzyme,MMR)系統(tǒng)含有9個基因，其中hMLH1(human mut-1 homologue 1，hMLH1)和hMSH2(human mut-s homologue 2,hMSH2)是人

3、類錯配修復(fù)系統(tǒng)中功能最重要的兩個基因，主要作用是保持遺傳物質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性，保證DNA復(fù)制的忠實性。如果這些錯配修復(fù)基因功能發(fā)生缺陷或活性降低，復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯誤不能及時被糾正，就會導(dǎo)致MSI的出現(xiàn)，使整個基因組不穩(wěn)定，隨機突變率增高，從而引起腫瘤的發(fā)生。高危型人乳頭狀瘤病毒(high risk humanpapillomavims,HR-HPV)尤其是HPV16與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)。本實驗主要采用分子生物學(xué)方法觀察分析慢性

4、宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變、宮頸鱗狀細胞癌中MSI的存在情況，并在此基礎(chǔ)上進一步探討以上宮頸組織中hMLH1和hMSH2的低表達情況和HPV16的感染狀況，通過研究三者之間的相關(guān)性，從而探討宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制。 方法： 1.材料：陰道鏡下活檢及手術(shù)切除的新鮮宮頸病變組織包括慢性宮頸炎16例、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變性CINI20例、CINII ～CINIII31例(包括按FIGO，2000分期0期原位癌)、宮頸癌52例。宮

5、頸癌按組織學(xué)分型：均為鱗癌；按組織學(xué)分級：高、中分化分化癌36例，低分化癌16例臨床分期按FIGO,2000年標準：Ⅰ期～Ⅱ期37例，Ⅲ期～Ⅳ期15例。同時取宮頸病變自身正常對照組織(如取材時可疑癌則取手術(shù)切除的標本邊緣)119例。所有標本均為新鮮標本，-160℃液氮保存或4％多聚甲醛固定。所有病例術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療，術(shù)后病理證實。 2.微衛(wèi)星不穩(wěn)定性MSI的檢測：選用RASSF1A基因的D3S2832E、RH91127

6、和SHGC-56838三個微衛(wèi)星位點，采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染技術(shù)(PCR-SSCP)的方法來檢測宮頸病變組織中RASSF1A基因MSI的情況。按照DNA提取試劑盒說明提取組織DNA，應(yīng)用相應(yīng)引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染進行分析。檢測結(jié)果判定：與正常組織相比，若病變組織出現(xiàn)DNA等位條帶的數(shù)量改變或條帶的移位及濃度改變，即判斷為MSI陽性。 3.錯配修復(fù)基因MMR的檢測：采

7、用免疫組織化學(xué)SP法來檢測宮頸病變組織中hMLM1和hMSH2基因的低表達情況，從而研究二者與宮頸各級病變的關(guān)系。 4 HPV16感染狀態(tài)的檢測：樣本組織HPV PCR檢測和電泳。若宮頸病變組織與HPV陽性標本對比，在對應(yīng)位置處出現(xiàn)相同的條帶，記為HPV陽性。 5 統(tǒng)計學(xué)方法：在宮頸各級病變中對RASSF1A基因的三個位點檢測MSI的差異，hMLM1、hMSH2蛋白缺失表達水平的差異，HPV16的感染狀況研究的計數(shù)資料用

8、行乘列表chi-squarex2檢驗和Fishers確切概率法，檢驗水準a為0.05，P＜0.05差異具有顯著性意義。宮頸病變MSI與錯配修復(fù)基因MMR(本文即hMLM1、hMSH2)蛋白低表達的相關(guān)性采用spearman rank correlation相關(guān)性檢驗。所有的計算均用SPSS14.0軟件包進行分析。 結(jié)果： 1.宮頸病變組織中MSI的檢測：宮頸病變旁正常對照組織中未檢測到微衛(wèi)星的存在；而在119例宮頸病變組

9、織慢性宮頸炎16例、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變性CINⅠ20例、CINⅡ℃INⅢ31例(包括0期原位癌)、高、中分化宮頸鱗狀細胞癌36例、低度分化鱗狀細胞癌16例，其中包括按FIGO，2000分期Ⅰ期～Ⅱ期37例、Ⅲ期～Ⅳ期15例MSI的檢出率分別為D3S2832E MSI的檢出率為0.0％、0.0％、22.6％、13.9％、43.8％，包括Ⅰ期～Ⅱ期13.5％、Ⅲ～期Ⅳ期46.7％；RH91127MSI的檢出率為0.0％、0.0％、19.4％、

10、11.1％、43.8％，包括Ⅰ期～Ⅱ期13.5％、Ⅲ期～Ⅳ期40.0％；SHGC-56838 MSI的檢出率為0.0％、0.0％、19.4.4％、11.1％、43.8％，包括Ⅰ期～Ⅱ期10.8％、Ⅲ-期Ⅳ期46.7％。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，三個位點均在慢性宮頸炎與宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變CIN、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變CIN與宮頸癌對照無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，做了進一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)CINⅠ與CINⅡ～CINⅢ、宮頸高、中分化癌與低分化癌、Ⅰ期～Ⅱ期宮頸癌

11、與Ⅲ～期Ⅳ期宮頸癌對照有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 2.hMLM1和hMSH2在宮頸病變組織中的表達結(jié)果：在119例宮頸宮頸病變組織慢性宮頸炎16例、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變性CINⅠ20例、CINⅡ～CINⅢ31例(包括0期原位癌)、高、中分化宮頸鱗狀細胞癌36例、低分化鱗狀細胞癌16例，按(FIGO，2000)分期，Ⅰ期～Ⅱ期37例、Ⅲ期～Ⅳ期15例中hMLH1低表達率分別為18.8％、20.0％、48.4％、44.4％、75％、

12、包括Ⅰ期～Ⅱ期43.2％、Ⅲ～期Ⅳ期80.0％；而hMSH2低表達率分別為12.5％、10.0％、41.9％、27.8％、62.5％，包括Ⅰ期～Ⅱ期24.3％、Ⅲ～期Ⅳ期73.3％。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，hMLH1和hMSH2兩種錯配修復(fù)酶的低表達情況均在慢性宮頸炎與宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變、富頸上皮內(nèi)瘤樣病變與宮頸癌對照無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，做了進一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)CINⅠ與CINⅡ～CINⅢ、宮頸高中分化鱗狀細胞癌與低分化鱗狀細胞癌、Ⅰ期～Ⅱ期

13、宮頸癌與Ⅲ期～Ⅳ期宮頸癌對照有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，hMLM1和hMSH2蛋白在宮頸病變中的低表達率隨著宮頸病變級別的增高而增高。 3.各組HPV16感染狀況的檢測：宮頸癌組與CIN組HPV感染陽性率明顯高于慢性宮頸炎組。隨著臨床分期和組織學(xué)分級的增加，HPV感染率也逐漸增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。而CINⅠ與CINⅡ～CINⅢ比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 4.宮頸病變中MSI與錯配修復(fù)基因M

14、MR(本文即hMLH1、hMSH2)蛋白低表達及HPV16的相關(guān)性：應(yīng)用Spearman rank correlatoin相關(guān)分析檢驗表明，三者之間的相關(guān)系數(shù)rs=1，均為正相關(guān)。 結(jié)論： 1.宮頸癌發(fā)生過程中MSI在宮頸癌中有較高的發(fā)生頻率，提示可能存在經(jīng)MSI途徑發(fā)生的宮頸癌。 2.三個微衛(wèi)星位點(D3S2832E、RH91127和SHGC-56838)的MSI發(fā)生頻率在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CINⅡ～Ⅲ)和宮

15、頸鱗狀細胞癌中較高，可能是宮頸癌MSI檢出的敏感位點，這對臨床MSI檢測指標的選用有一定參考價值。 3.在MSI宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能同時出現(xiàn)hMLH1和hMSH2表達降低，兩者的表達降低在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CINⅡ～Ⅲ)和宮頸鱗狀細胞癌中發(fā)生的頻率較高，而在正常宮頸組織中沒有表達降低， 4.HPV16的感染狀況表明，宮頸癌組與CIN組HPV16感染陽性率明顯高于慢性宮頸炎組，隨著臨床分期和組織學(xué)分級的增加，HP