基于cDNA芯片的玉米O2-o2 NIL胚乳差異表達基因的分析及O2啟動子結(jié)合蛋白的分離.pdf

1、玉米是我國重要的糧食和飼料作物。由隱性o2基因控制的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米（QPM）的籽粒中賴氨酸和色氨酸兩種單胃動物必需氨基酸的含量較普通玉米高出一倍左右。O2基因是玉米重要的轉(zhuǎn)錄因子基因，在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上參與調(diào)控玉米胚乳發(fā)育過程中多個基因的表達，其前導(dǎo)序列還可以調(diào)節(jié)自身基因的表達。闡明由o2基因引起胚乳醇溶蛋白合成的抑制、氨基酸代謝與淀粉合成的途徑改變、糖代謝水平下降、易感病感蟲、雄蕊早熟等生理、生化和表型改變的分子機理對促進玉米QPM

2、育種水平的提高具有重要的理論與實踐意義。 本研究選用玉米Hz85（O2/O2）/Hz85（o2/o2）和S7913（O2/O2）/S7913（o2/o2）兩套不同核背景下的近等基因系（NIL）為試材，提取授粉后3個不同天數(shù)（14、16、18DAP）的胚乳mRNA分別和本室已制備好的玉米胚乳全發(fā)育期的cDNA芯片雜交，在RNA水平上探討在顯性O(shè)2基因和隱性o2基因的調(diào)控下，玉米胚乳發(fā)育過程中的差異表達基因，對兩套NILs中均檢測到

3、相同差異的克隆進行序列分析，討論O2胚乳表型形成的分子機制。鑒定和分離O2基因啟動子的結(jié)合蛋白，探討調(diào)控O2基因表達的特異調(diào)控因子。獲得的主要結(jié)果如下： （1）在兩套近等基因系中均檢測到差異的克隆87個，對其進行序列分析得到24個TUGs、12個未命名蛋白和5個新序列。這些TUGs分別參與了生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)、物質(zhì)運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、電子傳遞鏈、細胞防御、代謝等細胞過程，以及作為細胞組分和貯存蛋白。 （2）與編碼醇溶蛋白（z

4、ein）家族的蛋白序列同源的序列分別編碼15kD、19kD及其各個亞基、突變的19kD、19kD前體、22kD、y-zein等家族成員。其中當(dāng)o2發(fā)生突變后，除了γ-zein外的克隆都以相似的表達趨勢下調(diào)表達：在o2/o2材料授粉后16天的胚乳中，與O2/O2材料比較發(fā)現(xiàn)，zein的差異表達倍數(shù)最高，即表達量達到最低值，而在授粉后18天差異表達倍數(shù)有所下降，即表達量有所上升，但較O2/O2還是下調(diào)表達。 （3）γ-zein基因表

5、現(xiàn)為16DAP基因達到表達量最高峰，而到18DAP表達量有所下降，和O2的表達趨勢相似。同時在o2/o2 NILs中修飾基因上調(diào)表達，表明本室采用MAS結(jié)合表型選擇所獲得的兩個NILs有效地保留了兩個親本的修飾基因，并在o2/o2胚乳中發(fā)揮了對胚乳的修飾作用。 （4）在o2/o2材料中檢測到透性酶基因、鐵離子接受蛋白基因和Sec61的a2型基因等與物質(zhì)運輸相關(guān)的克隆和ATPase，銅結(jié)合蛋白CUTA、過氧化物酶、Mn-過氧化物歧

6、化酶等與細胞防御相關(guān)的基因均在o2/o2材料都較O2/O2材料下調(diào)表達。在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，討論了o2籽粒粉質(zhì)不透明胚乳的形成可能是由于細胞膨大和物質(zhì)運輸能力、細胞防御能力下降造成的。 （5）選用玉米自交系HZ010519，提取胚乳核蛋白并從總DNA中特異擴增出O2基因啟動子序列，采用EMSA技術(shù)，獲得了O2啟動子序列與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生的阻滯條帶。采用Dynabead磁珠分離技術(shù)得到與O2啟動子序列結(jié)合的3個蛋白質(zhì)，質(zhì)譜分析結(jié)果顯