豬O3FAR1基因啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析.pdf

1、因?yàn)樵谶z傳以及理化因素等方面與人存在很大的相似性，豬，這一主要家畜，常常作為模型被用于一些疾病的研究，比如說糖尿病和肥胖，脂代謝紊亂等。近年來，游離脂肪酸的生理功能受到廣泛關(guān)注，因?yàn)槠洳粌H可以為組織提供能量而且還可以作為信號(hào)分子介導(dǎo)各種細(xì)胞進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、肥胖、脂代謝紊亂與外周游離脂肪酸水平的升高存在著緊密的聯(lián)系。O3FAR1是新發(fā)現(xiàn)的的長鏈脂肪酸受體，體內(nèi)的脂質(zhì)生成、細(xì)胞增殖、激素分泌等代謝過程都存在著O3FAR1的參與。O

2、3FAR1被認(rèn)為與某些疾病有關(guān)，可以把它當(dāng)作一些疾病的藥物靶點(diǎn)，比如說肥胖癥，糖尿病等。
　　在基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制中，基因的轉(zhuǎn)錄是一個(gè)非常主要的過程，它在遺傳信息傳遞中起到著紐帶的作用。而轉(zhuǎn)錄的頻率和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)受到啟動(dòng)子這一關(guān)鍵的元件調(diào)控。啟動(dòng)子主要通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，來調(diào)控基因的表達(dá)。啟動(dòng)子的識(shí)別，對(duì)于闡述基因的功能來說有著非常重要的作用。為了進(jìn)一步了解豬O3FAR1基因的功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，我們克隆出豬O3FAR1基因的啟

3、動(dòng)子區(qū)域，并對(duì)其核心區(qū)域進(jìn)行研究，研究結(jié)果如下:
　　(1)利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了豬的O3FAR1基因在各個(gè)組織的表達(dá)情況，并繪制了組織表達(dá)譜。從結(jié)果來看，豬O3FAR1基因的表達(dá)比較廣泛，在不同組織中表達(dá)量不同。在小腸中表達(dá)量很高，但是在脂肪組織中，表達(dá)量明顯高于其他組織。
　　(2)從NCBI獲取O3FAR1基因5'端上游調(diào)控序列，以此為模板，我們克隆了豬O3FAR1基因5'端上游調(diào)控序列2003bp。利用Prom

4、oterScan、Promoter2.0、TFsearch等在線工具分析預(yù)測該基因的5'端上游調(diào)控序列，發(fā)現(xiàn)存在很多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，比如sp1，C/EBP，GATA-1等。與此同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)CpG島。
　　(3)通過對(duì)不同物種O3FAR1基因的比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)，O3FAR1基因是一個(gè)比較保守的基因。在鼠、人、狗、豬等動(dòng)物中存在較高的保守性。豬和鼠、人、狗的相似度分別為86.98％、82.23％、89.47％。
　　(4)利

5、用PGL3-BASIC雙熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建了7個(gè)缺失片段，并將其轉(zhuǎn)染至3種細(xì)胞中，檢測熒光活性。發(fā)現(xiàn)缺失片段PGL3-P7具有較高的活性，推測核心啟動(dòng)子區(qū)可能位于-298bp/+78bp的范圍內(nèi)。
　　(5)通過對(duì)PGL3-P7的分析發(fā)現(xiàn)，在此區(qū)域內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的結(jié)合位點(diǎn)。通過點(diǎn)突變試驗(yàn)分別構(gòu)建野生型和突變型質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變的質(zhì)粒載體熒光活性確實(shí)顯著降低。
　　(6)超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ后，利用RT

6、-PCR檢測O3FAR1基因的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)mRNA水平上升極顯著(P＜0.01);利用siRNA技術(shù)干擾細(xì)胞內(nèi)源性C/EBPβ后，發(fā)現(xiàn)O3FAR1基因的mRNA水平顯著下降(P＜0.05)。
　　(7)根據(jù)預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列設(shè)計(jì)探針，利用EMSA技術(shù)從蛋白水平證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ確實(shí)與O3FAR1基因啟動(dòng)子結(jié)合。
　　(8)利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1與獲得的O3FAR1基因CDS區(qū)，構(gòu)建了豬O3FAR1基