玉米胚乳特異性啟動子的克隆與表達分析.pdf

1、玉米胚乳中存在著大量與淀粉合成酶、醇溶蛋白合成酶、谷蛋白合成酶相關的基因，并且有部分受胚乳特異性啟動子調控，只在胚乳中特異性表達。隨著轉基因技術的快速發(fā)展及轉基因研究領域的不斷擴大，對組織特異性啟動子的研究逐步受到重視。本研究旨在從玉米自交系18-599紅中克隆淀粉合成酶基因ZMGBSS、谷蛋白基因ZMGT1、SC3以及醇溶蛋白基因ZEIN、BN15D14A的啟動子GBSS、GT、SC、ZEIN、BN，對其表達的組織特異性及外界誘導因素

2、進行分析，構建了這些啟動子的瞬時表達載體，利用基因槍法通過轉化胚乳，分析其啟動活性。研究結果如下:
　　1、利用高保真酶KOD Fx從玉米自交系18-599紅基因組DNA成功克隆出2000bp左右的胚乳特異性啟動子GBSS、GT、SC、ZEIN、BN序列，并對克隆片段進行回收測序。將測序結果與NCBI上B73的基因組信息比對，其相似性分別為97％、99％、99％、97％和99％。
　　2、提取玉米自交系18-599紅授粉15

3、天后的胚乳和胚以及出苗10天后的根和葉的RNA，反轉錄成eDNA，以18s rRNA作為內參對ZMGBSS、ZMGT1、SC3、ZEIN、BN15D14A基因進行半定量PCR分析，結果表明，ZMGBSS和ZEIN在胚乳的表達量明顯高于在其他組織。而ZMGT1、SC3、BN15D14A沒有表現(xiàn)出明顯的組織特異性。
　　3、通過熒光實時定量PCR對基因ZMGBSS、ZMGT1、SC3、ZEIN、BN15D14A受外源激素誘導后的表達進

4、行分析，結果表明，ABA誘導可導致基因ZMGBSS和ZEIN的表達量明顯提高。蔗糖誘導可導致基因ZMGT1和BN15D14A的表達量明顯提高。
　　4、構建了啟動子GBSS、GT、SC、ZEIN和BN的瞬時表達載體，即pGBSS-Lue、pGT-Lue、pSC-Lue、pZEIN-Lue和pBN-Lue，同時構建了瞬時表達載體pUbi-Lue作為對照，構建了瞬時表達載體pUbi-Gus作為內參，內參對照主要用來消除不同轉化所導致的

5、差異。將內參載體與目的載體按照質量比為1∶4的比例混合，基因槍轉化，轉化材料為4小時預處理過后的授粉15天后18-599紅的胚乳。結果表明，啟動子GBSS、ZEIN和BN的啟動活性相對高于SC和BN，但均明顯低于組成型啟動子Ubiquitin。
　　5、在外源因素誘導表達分析中，轉化受體材料分別為葡萄糖、蔗糖、ABA和GA誘導4h后的胚乳，利用基因槍轉化法，按照內參載體與目的載體以1∶4的比例混合進行轉化，結果表明，受到ABA誘導