筋脈通對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)及雪旺細(xì)胞DNA氧化損傷致細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、[目的]
　　 從整體、細(xì)胞及分子水平,研究中藥筋脈通對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)DNA氧化損傷致細(xì)胞凋亡的作用,以及筋脈通含藥血清對由于高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞DNA氧化損傷致細(xì)胞凋亡的影響。
　　 [方法]
　　 1.整體實驗
　　 建立糖尿病大鼠模型,隨機(jī)分為模型對照組、筋脈通小劑量、中劑量、大劑量組及維生素C組,每組14只。以體重、鼠齡及性別相匹配的正常大鼠10只作為正常對照組。筋脈通小、中、大組分別按成人劑量5

2、倍、10倍和20倍給藥；維生素C組按成人劑量10倍給藥。模型組和正常組灌服蒸餾水。所有實驗大鼠于灌胃16w處死。檢測各組治療前及治療后4w、8w、12w和16w的體重和血糖變化,治療后16w大鼠機(jī)械痛閾,并檢測大鼠坐骨神經(jīng)8-OHdG、PARP-1(89kDa)及活化的Caspase-3(17kDa)的表達(dá)。
　　 2.細(xì)胞實驗
　　 體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞,并通過S-100蛋白法進(jìn)行鑒定。取第3代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞,加入含50m

3、molGlu DMEM培養(yǎng)基,用含筋脈通(JMT)和維生素C(VC)的鼠血清加入到上述含50nmolGluDMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行共同培養(yǎng)。干預(yù)48h后,采用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)檢測活性氧熒光探針、活化的caspase-3(17kDa)的表達(dá)；采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液8-OHdG的分泌量；采用Western Blot的方法檢測細(xì)胞PARP-1(89kDa)的蛋白表達(dá)；采用實時熒光定量PCR法檢測Caspase-3mRNA的表達(dá)。

4、r>　　 [結(jié)果]
　　 1.整體實驗
　　 (1)血糖和體重的變化
　　 STZ—DM大鼠血糖與正常組相比均明顯升高(P<0.01)。藥物干預(yù)后,治療組血糖在同一時間點與模型組相比無明顯差異(P>0.05),治療組間血糖在各時間點均無明顯差異(P>0.05)。干預(yù)前后,各組大鼠的體重在同一時間點無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (2)筋脈通對大鼠機(jī)械痛閾值的影響
　　 與正常組比較,模型組

5、的機(jī)械痛閾值顯著降低(P<0.01)；各治療組的機(jī)械痛閾值均有不同程度降低,但與模型組比較,各治療組閾值明顯升高(P<0.01)；各治療組之間比較,筋脈通中劑量組較其它各治療組均有顯著升高(P<0.01)。
　　 (3)筋脈通對坐骨神經(jīng)8-OHdG表達(dá)的影響
　　 與正常組比較,模型組的積分光密度值增高,差異非常顯著(P<0.01)；各治療劑量組的積分光密度值均較正常組增高(P<0.01),但較模型組降低(P<0.01)

6、。筋脈通中劑量組積分光密度值明顯低于其它各治療組(P<0.01),維生素C組與筋脈通大劑量組的結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),均低于筋脈通小劑量組(P<0.05)。
　　 (4)筋脈通對坐骨神經(jīng)PARP-1(89kDa)表達(dá)的影響
　　 筋脈通大、中、小劑量組和維生素C組的蛋白譜密度值均較模型組顯著降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.05)。各治療組之間比較,筋脈通中劑量組的蛋白譜密度值明顯低于其它

7、各治療組(P<0.01)；與維生素C組比較,筋脈通大劑量組的蛋白譜密度值降低(P<0.05),筋脈通小劑量組的結(jié)果則與其無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (5)筋脈通對坐骨神經(jīng)活化的caspase-3(17kDa)蛋白表達(dá)的影響
　　 與正常組比較,模型組的積分光密度值顯著增高(P<0.01)；筋脈通大、中、小組和維生素C組的積分光密度值較DM組降低(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.05)。各治療組

8、之間比較,筋脈通中劑量組明顯低于其它各治療組(P<0.01),維生素C組和筋脈通大劑量組的結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),但較筋脈通中劑量組和小劑量組增高且差異顯著(P<0.01,P<0.05)。
　　 (6)筋脈通對坐骨神經(jīng)caspase-3(17kDa)mRNA表達(dá)的影響
　　 各治療組和模型組caspase-3 mRNA表達(dá)增加明顯(P<0.01)。各治療組之間比較,筋脈通中劑量組caspase-3 mRNA表達(dá)

9、明顯低于其它各治療組(P<0.01),維生素C組和筋脈通大劑量組及小劑量組結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),但與筋脈通中劑量組結(jié)果增高且差異顯著(P<0.01)。
　　 (7)坐骨神經(jīng)活化的Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析
　　 統(tǒng)計學(xué)直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),各組大鼠坐骨神經(jīng)活化的Caspase-3蛋白和mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.935,P<0.01)
　　 2.細(xì)胞實驗
　　 (1)筋

10、脈通含藥血清對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響
　　 與正常組比較,50mmolGlu高糖組雪旺細(xì)胞以及治療組筋脈通含藥血清組和維生素C含藥血清組的ROS—DCF熒光強(qiáng)度值均增高,差異非常顯著(P<0.01)。與50mmolGlu高糖組相比,治療組的ROS—DCF熒光強(qiáng)度值均顯著降低(P<0.01)。治療組間比較,筋脈通含藥血清組ROS—DCF的熒光強(qiáng)度值低于維生素C含藥血清組,但2組熒光強(qiáng)度值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　

11、 (2)筋脈通含藥血清對細(xì)胞上清液8-OHdG含量的影響
　　 與正常組比較,50mmolGlu高糖組細(xì)胞上清液8-OHdG含量顯著增高(P<0.01)。筋脈通含藥血清組及維生素C含藥血清組細(xì)胞上清液8-OHdG的含量均較正常組增高,差異非常顯著(P<0.01),但較50mmolGlu高糖組降低,差異非常顯著(P<0.01)。治療組間比較,筋脈通含藥血清組細(xì)胞上清液8-OHdG的含量低于維生素C含藥血清組,差異顯著(P<0.05

12、)。
　　 (3)筋脈通含藥血清對細(xì)胞內(nèi)PARP-1(89kDa)蛋白表達(dá)的影響
　　 與正常組比較,50mmolGlu高糖組、筋脈通含藥血清組及維生素C含藥血清組雪旺細(xì)胞內(nèi)PARP-1(89kDa)含量明顯增加(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。與50mmolGlu高糖組比較,筋脈通含藥血清組含量明顯降低,差異非常顯著(P<0.01)；維生素C組雪旺細(xì)胞內(nèi)PARP-1(89kDa)含量亦降低(P<0.05)。

13、治療組間比較,筋脈通含藥血清組含量明顯低于維生素C組,差異非常顯著(P<0.01)。
　　 (4)筋脈通含藥血清對細(xì)胞內(nèi)活化的Caspase-3(17kDa)蛋白表達(dá)的影響
　　 與正常組比較,50mmolGlu高糖組、筋脈通含藥血清組及維生素C含藥血清組雪旺細(xì)胞中活化的Caspase-3的熒光強(qiáng)度值明顯增高(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。與50mmolGlu高糖組相比,筋脈通含藥血清組強(qiáng)度值降低,差異非常

14、顯著(P<0.01),維生素C組強(qiáng)度值亦降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。治療組間比較,筋脈通含藥血清組熒光強(qiáng)度值低于維生素C組,差異非常顯著(P<0.01)。
　　 (5)筋脈通含藥血清對細(xì)胞內(nèi)活化的Caspase-3(17kDa)mRNA表達(dá)的影響
　　 與正常組比較,高糖培養(yǎng)的各組雪旺細(xì)胞中活化的caspase-3 mRNA表達(dá)增加明顯(P<0.01)。與50mmolGlu高糖組相比,筋脈通含藥血清組mRNA表

15、達(dá)明顯降低(P<0.01),而維生素C含藥血清組亦降低但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。治療組間比較,筋脈通含藥血清組較維生素C組mRNA明顯降低,差異顯著(P<0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.整體實驗
　　 (1)空腹單次腹腔注射STZ60mg/kg后16周DPN模型成功建立,筋脈通可以提高大鼠機(jī)械痛閾值,改善DPN大鼠痛覺過敏。(2)筋脈通可減少DPN大鼠坐骨神經(jīng)中8-OHdG的表達(dá),可以減輕DPN

16、大鼠周圍神經(jīng)組織因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA氧化損傷。(3)筋脈通可減少DPN大鼠坐骨神經(jīng)中PARP-1(89kDa)的表達(dá),抑制PARP—1酶解,在一定程度上防止DPN大鼠周圍神經(jīng)細(xì)胞因DNA損傷而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的啟動。(4)筋脈通可下調(diào)DPN大鼠坐骨神經(jīng)中活化的caspase3蛋白及mRNA的表達(dá),減少DPN大鼠周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　 2.細(xì)胞實驗
　　 (1)高糖培養(yǎng)環(huán)境下雪旺細(xì)胞ROS和8-OHdG表達(dá)增高,提示雪旺細(xì)

17、胞內(nèi)存在氧化應(yīng)激反應(yīng)并造成細(xì)胞DNA氧化損傷。(2)筋脈通含藥血清能顯著降低ROS和8-OHdG表達(dá),證明筋脈通有一定抗氧化應(yīng)激作用,并能夠減輕細(xì)胞DNA氧化損傷。(3)筋脈通含藥血清能的降低PARP-1的活性和酶解,減少細(xì)胞凋亡,可能是通過抑制DNA氧化損傷途徑實現(xiàn)的。
　　 [創(chuàng)新點]
　　 從整體、細(xì)胞及分子水平,通過氧化應(yīng)激-DNA氧化損傷-細(xì)胞凋亡途徑,研究中藥筋脈通對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)的保護(hù)作用,以及筋脈通含