中藥筋脈通對糖尿病大鼠神經(jīng)生長因子及對雪旺細(xì)胞作用的研究.pdf

1、目的： 1.觀察筋脈通對STZ-DM大鼠模型的熱水甩尾試驗(yàn)、機(jī)械痛閾以及坐骨神經(jīng)中NGF和NGF-mRNA表達(dá)的影響。 2.觀察筋脈通含藥血清對高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的增殖及其分泌NGF的影響。 方法： 1.整體實(shí)驗(yàn)：用鏈脲佐菌素(STZ，60mg/kg)一次性腹腔內(nèi)注射wistar大鼠的方法制作糖尿病模型，簡單隨機(jī)分為5組：模型對照組、筋脈通小劑量、中劑量和大劑量組及神經(jīng)妥樂平組，每組各10只。以體重、鼠齡相

2、匹配的正常大鼠10只作為正常對照組。成模后即開始灌胃給藥，筋脈通小、中、大組分別按成人劑量的5倍、10倍和20倍給藥；神經(jīng)妥樂平組按成人劑量的10倍給藥。模型組和正常組予灌服蒸餾水1mL/100g/d。所有實(shí)驗(yàn)大鼠于灌胃16w后處死。檢測各組治療前及治療后4w、8w、12w和16w的體重和血糖變化，并進(jìn)行熱水甩尾試驗(yàn)和機(jī)械痛閾檢測，采用免疫組化染色法測定坐骨神經(jīng)中NGF的表達(dá)，實(shí)時熒光定量PCR法檢測坐骨神經(jīng)中NGF-mRNA的表達(dá)。

3、 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：從Wistar乳鼠坐骨神經(jīng)取材，采用反復(fù)植塊法、差速貼壁法+低濃度胰蛋白酶消化法+G418來培養(yǎng)和純化雪旺細(xì)胞，S-100蛋白免疫組化法進(jìn)行鑒定。取第3代雪旺細(xì)胞，加入DMEM、50mMGlu、75mMGlu培養(yǎng)液以及含葡萄糖50mM的筋脈通未稀釋(JMT1:1)、筋脈通1:2稀釋(JMT1:2)、筋脈通1:8稀釋(JMT1:8)和神經(jīng)妥樂平(Ntp)含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)立空白對照組，于培養(yǎng)24h、48h、72h及

4、96h后行MTT比色試驗(yàn)，觀察雪旺細(xì)胞增殖活性的變化。并采用共聚焦激光掃描顯微鏡術(shù)，進(jìn)一步檢測DMEM、50mMGlu培養(yǎng)基以及含葡萄糖50mM的JMT1:2、Ntp含藥血清培養(yǎng)48h后雪旺細(xì)胞內(nèi)NGF表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： 1.整體實(shí)驗(yàn) (1)血糖和體重監(jiān)測：STZ-DM大鼠血糖值均顯著高于正常組(P<0.01)；各治療組血糖在各時間點(diǎn)與模型組相比無明顯差異(P>0.05)；灌胃前后，各組大鼠的血糖水平無明顯

5、變化(P>0.05)。造模及灌胃前后，各組大鼠之間的體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。 (2)熱水甩尾試驗(yàn)：模型組和各治療組的甩尾潛伏期均較正常組顯著延長(P<0.01或P<0.05)。與模型組相比，筋脈通小、中劑量組與神經(jīng)妥樂平組的甩尾潛伏期顯著縮短(P<0.05)；筋脈通大劑量組無明顯變化(P>0.05)。筋脈通各劑量組與神經(jīng)妥樂平組相比無顯著差異(P>0.05)。 (3)機(jī)械痛閾檢測：與正常組相比，模型組和筋脈通大劑

6、量組的痛閾值降低非常顯著(P<0.01)；筋脈通小、中劑量組與神經(jīng)妥樂平組無明顯降低(P>0.05)。與模型組相比，筋脈通小、中劑量組與神經(jīng)妥樂平組的痛閾值顯著升高(P<0.05)；筋脈通大劑量組升高不明顯(P>0.05)。筋脈通各劑量組與神經(jīng)妥樂平組相比無顯著差異(P>0.05)。 (4)坐骨神經(jīng)NGF表達(dá)：模型組和各治療組的積分光密度值較正常組顯著下降非常(P

7、增大(P0.05)。 (5)坐骨神經(jīng)NGF-mRNA表達(dá)：模型組及各治療組的NGF-mRNA值均較正常組非常顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，筋脈通中劑量組和神經(jīng)妥樂平組的NGF-mRNA值均有明顯上調(diào)(P<0.01)；筋脈通大、小劑量組無顯著變化(P>0.05)。與筋脈通大劑量組相比，筋脈通中劑量組和神經(jīng)妥樂平組的NGF-mRNA值明顯增高(P<0.05)；筋脈通

8、小劑量組無顯著差異(P>0.05)。 (6)Spearman相關(guān)分析顯示：坐骨神經(jīng)NGF-mRNA的表達(dá)水平與甩尾潛伏期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.467，P<0.01)；與機(jī)械痛閾值呈正相關(guān)(r=0.394，P<0.05)。 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn) (1)MTT比色實(shí)驗(yàn)：①原代培養(yǎng)的乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞在工作培養(yǎng)基培養(yǎng)的第24h～72h快速增殖、生長旺盛；72h后增殖明顯減緩。②在50mMGlu及75mMGlu高糖環(huán)境中，雪旺細(xì)

9、胞的OD值較DMEM培養(yǎng)液普遍減小，48h后顯著降低(P<0.05或P<0.01)。③與50mMGlu組相比，75mMGlu組在24h、48h及72h時的OD值無顯著性差異(P>0.05)，在96h時顯著降低(P(0.05)。④Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)雪旺細(xì)胞的增殖與葡萄糖濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.471，P<0.01)；排除了時間因素后的偏相關(guān)分析顯示二者仍呈負(fù)相關(guān)(r=-0.679，P<0.01)。⑤JMT1:1組的雪旺細(xì)胞在24

10、～72h持續(xù)增殖，在72h以后衰減；JMT1:2組和Ntp組的雪旺細(xì)胞在24～48h增殖明顯，在48～72h時減慢，72h后開始衰減；JMT1:8組的雪旺細(xì)胞隨著時間的延長逐漸遞增。⑥在24h時各組之間的OD值無顯著性差異(P>0.05)。在48h時：與50mMGlu組相比，JMT1:2組與Ntp組的OD值顯著升高(P<0.05)；與Ntp組相比，JMT1:1組的OD值非常顯著降低(P<0.01)。在72h時：與Control組相比，5

11、0mMGlu組及JMT1:1組、JMT1:2組與Ntp組的OD值顯著下降(P<0.01或P<0.05)；JMT1:8組無明顯下降(P>0.05)。在96h時：與50mMGlu組相比，JMT1:2組的OD值顯著降低(P<0.05)；其它組則無顯著變化(P>0.05)。 (2)共聚焦激光掃描顯微鏡檢測：①50mMGlu組及治療組的雪旺細(xì)胞表達(dá)NGF的熒光強(qiáng)度值較Control組明顯降低(P<0.01)。②與50mMGlu組相比，JMT1:2

12、組與Ntp組的雪旺細(xì)胞表達(dá)NGF的熒光強(qiáng)度值明顯升高(P(0.01)，二者無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.整體實(shí)驗(yàn)：(1)空腹單次腹腔注射STZ 60mg/kg后16周，大鼠出現(xiàn)痛覺過敏和溫度覺減退，提示有感覺神經(jīng)纖維受累，DPN造模成功。(2)DPN大鼠坐骨神經(jīng)中NGF及NGF-mRNA表達(dá)水平顯著下降，減弱了受損神經(jīng)纖維的修復(fù)再生能力。(3)STZ-DM大鼠的痛覺過敏和溫度覺減退與坐骨神經(jīng)NGF-mRNA的

13、表達(dá)下降有關(guān)。(4)筋脈通可顯著改善DPN大鼠的痛覺過敏和溫度覺減退、上調(diào)坐骨神經(jīng)中NGF及NGF-mRNA的表達(dá)，中劑量組效果最好，療效與神經(jīng)妥樂平相似。(5)筋脈通具有防止DPN大鼠周圍神經(jīng)組織進(jìn)一步損傷、促進(jìn)受損神經(jīng)纖維修復(fù)再生的功能。此作用不是通過降低血糖實(shí)現(xiàn)的，且與胰島素應(yīng)用無關(guān)。 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：(1)采用組織貼塊法原代培養(yǎng)、經(jīng)差速貼壁法+低濃度胰蛋白酶消化法+G418純化的wistar乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞，經(jīng)S-10

14、0蛋白免疫組化鑒定，純度可達(dá)90％左右。(2)原代培養(yǎng)的乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞于第24～72h生長旺盛；72h后增殖明顯減緩。(3)高糖對雪旺細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，與葡萄糖濃度呈顯著負(fù)相關(guān)。(4)高糖使雪旺細(xì)胞分泌NGF的能力明顯降低。(5)筋脈通含藥血清可有效促進(jìn)高糖環(huán)境培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞的增殖能力及其分泌NGF的水平，作用與神經(jīng)妥樂平含藥血清相似。 創(chuàng)新點(diǎn)： 從整體、細(xì)胞及分子水平，研究中藥筋脈通對糖尿病大鼠的溫度覺、