鵝熱休克蛋白70的表達(dá)提純與病毒復(fù)合物形成的研究.pdf

1、熱休克蛋白70(HSP70)作為一種重要的伴隨細(xì)胞蛋白，能夠參與細(xì)胞修復(fù)和抗應(yīng)激活動(dòng)，對(duì)于細(xì)胞健康至關(guān)重要，同時(shí)它還是引導(dǎo)抗原進(jìn)入MHCI類(lèi)途徑進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞免疫的“細(xì)胞因子”和在異體間傳遞抗病毒和腫瘤細(xì)胞免疫力的重要介質(zhì)，為細(xì)胞內(nèi)病毒感染及腫瘤的預(yù)防和治療提供了可貴的解決途徑，正為動(dòng)植物醫(yī)學(xué)和人類(lèi)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究人員所熱切關(guān)注，成為當(dāng)前免疫學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)新的熱點(diǎn)。 關(guān)于禽類(lèi)熱休克蛋白的研究文獻(xiàn)極少，其中關(guān)于鵝的則尚未報(bào)道。禽類(lèi)的M

2、HC和哺乳動(dòng)物的MHC有很多差異，禽類(lèi)HSP70是否能夠參與對(duì)病毒的特異性免疫的問(wèn)題，至今還沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論，禽HSP70和抗熱應(yīng)激及抗病毒感染的關(guān)系還有待探討。 為研究HSP70在熱應(yīng)激的特異性表達(dá)，組織中HSP70的分離純化及其結(jié)合抗原肽形成復(fù)合物的特性，設(shè)計(jì)此試驗(yàn)。選取6w的健康五龍鵝隨機(jī)分為三組，第1組(對(duì)照組)鵝不經(jīng)熱處理后宰殺，第2組(試驗(yàn)1組)鵝進(jìn)行1次43±1℃、5h的急性熱處理后立即宰殺，第3組(試驗(yàn)2組)鵝進(jìn)行

3、1次43±1℃、5h的急性熱處理后，在正常飼養(yǎng)條件下恢復(fù)12h后宰殺。取血液，檢測(cè)血清中多種酶的活性以及多種離子濃度的變化；取心臟，做常規(guī)石蠟切片，以SP免疫組化法檢測(cè)HSP70的表達(dá)；肝臟速凍后以備HSP70蛋白提純之用。比較3組鵝心臟HSP70表達(dá)的差異，同時(shí)對(duì)試驗(yàn)組肝臟中的HSP70進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行鑒定。純化后的HSP70和人工合成的乙肝病毒(HBV)前S1多肽在體外相結(jié)合形成復(fù)合物，設(shè)計(jì)雙特異抗體夾心法檢測(cè)其復(fù)合物的形成。

4、 研究結(jié)果表明： 1.熱應(yīng)激前后血漿中多種生理生化指標(biāo)的變化，反映了熱應(yīng)激對(duì)于機(jī)體的嚴(yán)重影響。高熱對(duì)多種血漿酶活力有明顯的影響，導(dǎo)致GPT、AKP、LDH活性分別對(duì)照下降42.37％，32.85％和26.25％，差異極顯著(p＜0.01)，ACP活性對(duì)照下降20.00％，差異顯著(p＜0.05)，GOT活性?xún)山M差異不顯著(p＞0.05)；熱應(yīng)激對(duì)于血漿中多種離子濃度的含量亦有明顯的影響，致使Ca、P、Na和K濃度分別對(duì)照下

5、降22.04％，13.19％，20.72％和30.91％，差異均顯著(p＜0.05)；血漿pH值差異不顯著(p＞0.05)，但從數(shù)值上看有所上升，血液的堿性增加。 2.通過(guò)免疫紐化法檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)紐心臟切片中HSP70的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)正常情況下五龍鵝心肌組織中HSP70表達(dá)為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞率僅為0.6％；而熱應(yīng)激狀態(tài)下心肌纖維中有廣泛的HSP70陽(yáng)性顆粒，血管壁上陽(yáng)性顆粒尤為明顯：應(yīng)激后立即宰殺紐中HSP70表達(dá)重點(diǎn)部位在核膜及其

6、周?chē)?，?yáng)性顆粒聚集成團(tuán)塊狀或絮狀，陽(yáng)性細(xì)胞率為76.0％，而恢復(fù)12h后的鵝只其心肌HSP70表達(dá)重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到胞膜周?chē)?yáng)性顆粒聚集呈長(zhǎng)條狀，陽(yáng)性細(xì)胞率為88.4％。兩個(gè)試驗(yàn)組之間的陽(yáng)性細(xì)胞率差異不顯著(p＞0.05)，但試驗(yàn)2組的陽(yáng)性細(xì)胞率相對(duì)要高。本試驗(yàn)暗示著HSP70和保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激傷害可能有著密切的聯(lián)系。 3.本試驗(yàn)中自行設(shè)計(jì)了兩套低值高效的低壓層析流程，首次嘗試從成分復(fù)雜的鵝肝組織中分離純化HSP70，并對(duì)參考文獻(xiàn)所述

7、方法進(jìn)行了完善和改進(jìn)，摒棄了傳統(tǒng)純化方式的高等儀器依賴(lài)性，改善其普及性。通過(guò)SephacrylS-300初步分離，ConA-Agarose親和層析和DEAE離子交換層析的方式純化蛋白得到HSP70純化物，純度達(dá)85％以上，蛋白得率為0.115mg/g；通過(guò)SephacrylS-300初步分離，ConA-Agrose和ADP-Agarose親和層析能得到目的蛋白純化物，純度達(dá)95％，蛋白得率為0.157mg/g；兩種方式均可有效分離目的蛋

8、白，相比較而言，SephacrylS-300初步分離，ConA-Agrose和ADP-Agarose親和層析這套流程效果更好。WesternBlot證明兩種方式所得蛋白均為HSP70。 4.人工合成HBV的PreS1抗原中的主要抗原決定簇，作為半抗原和一定載體蛋白相結(jié)合后免疫家兔，制備半抗原的特異性抗體；同時(shí)，合成肽在一定條件下與純化所得的HSP70在體外形成復(fù)合物，經(jīng)所制備的多肽抗體和商品HSP70多克隆抗體通過(guò)雙特異性抗體夾