肉雞熱應(yīng)激損傷與熱休克蛋白70表達的研究.pdf

1、熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是在機體受到應(yīng)激原的刺激后產(chǎn)生的 幾族蛋白質(zhì)，具有高度保守性，對維持細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。HSPs 具有多種生物學(xué)功能，如分子伴侶作用、協(xié)同免疫作用、抗細(xì)胞凋亡作用和抗應(yīng)激作 用等，其中分子伴侶作用是其最基本的生物學(xué)功能。HSPs作為一類重要的非特異性細(xì) 胞保護蛋白，在應(yīng)激耐受和應(yīng)激保護中發(fā)揮重要作用。通常人們根據(jù)HSPs的分子量 大小，將其分成6個家族

2、：小分子量HSPs家族、HSP40家族、HSP60家族、HSP70 冢族、HSP90家族和大分子HSPs家族。其中HSP70家族是最保守和最重要的一族，在 大多數(shù)生物中含量最多，在細(xì)胞應(yīng)激后生成最顯著，家族成員也最多。本文主要從肉 雞的熱應(yīng)激損傷、HSP70 mRNA水平的變化、HSP70蛋白水平的改變等方面探討肉雞 熱應(yīng)激損傷與熱休克蛋白70表達的相關(guān)性。 將120只30日齡的肉雞隨機分為對照組、熱應(yīng)激6 h組、熱應(yīng)激

3、12 h組、熱應(yīng) 激18 h組、熱應(yīng)激24 h組和熱應(yīng)激48 h組共6組。經(jīng)過30天的適應(yīng)性飼養(yǎng)后， 除對照組不進行熱應(yīng)激處理，溫度控制在25±1℃外，熱應(yīng)激組的環(huán)境溫度在20 min 。 內(nèi)從室溫突然升至40±1℃。按照試驗設(shè)定的時間，分別剖殺對照組雞和熱應(yīng)激處理 雞，取全血制備血清，同時取肉雞心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胸腺和法氏囊 等組織，一部分固定在10％中性福爾馬林溶液中，一部分速凍于液氮并置-70℃冰柜 中保

4、存。 通過測定血清中肌酸激酶(CK)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性，觀察熱應(yīng)激對肉雞的組織病理損傷(主要是心臟和肝臟)程度。試驗結(jié)果顯示，熱應(yīng)激過程中CK和GPT的含量呈現(xiàn)波動性變化，熱應(yīng)激12 h時CK和GPT呈現(xiàn)較高水平，提示此階段心肌和肝臟發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷；熱應(yīng)激24 h時CK和GPT呈現(xiàn)較低水平，提示此時熱應(yīng)激對心肌和肝細(xì)胞損傷有所緩和。進一步通過受試雞心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胸腺和法氏囊等組織的組織病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心臟主要

5、表現(xiàn)為心肌纖維斷裂，肝臟和腎臟主要表現(xiàn)為細(xì)胞壞死，肺臟主要表現(xiàn)為出血和壞死，脾臟、胸腺和法氏囊主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞壞死。 通過RNA探針的原位雜交試驗研究誘導(dǎo)型熱休克蛋白70(HSP70)mRNA在肉雞心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胸腺和法氏囊等組織中的分布情況。結(jié)果顯示，熱應(yīng)激時HSP70 mRNA主要分布在肝臟和肺臟中，尤其在血管壁或血管周圍最為明顯；心臟也有少量陽性信號；腎臟結(jié)果可疑；脾臟、胸腺和法氏囊等組織未出現(xiàn)陽性信號。

6、結(jié)果提示熱應(yīng)激時HSP70與心血管系統(tǒng)具有一定的相關(guān)性，可能與心血管系統(tǒng)的損傷和功能有關(guān)。進一步通過熒光定量PCR方法檢測熱應(yīng)激肉雞心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胸腺和法氏囊等組織中結(jié)構(gòu)型熱休克蛋白70(HSC70)mRNA和誘導(dǎo)型熱休克蛋白70(HSP70)mRNA含量。結(jié)果顯示，持續(xù)熱應(yīng)激過程中HSC70 mRNA和HSP70 mRNA含量都表現(xiàn)出一定的波動性，HSC70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，而HSP70 mR

7、NA轉(zhuǎn)錄水平主要呈現(xiàn)出升高的特點。通過RT-PCR方法擴增肉雞HSP70 C端eDNA序列并克隆到pGEM-T Easy載體，再經(jīng)Nde I／Xho I雙酶切構(gòu)建原核表達載體PET28-HSP70，得到表達工程菌BL-21。誘導(dǎo)表達菌經(jīng)超聲波破碎，表達產(chǎn)物存在于上清液，說明肉雞HSP70在表達工程菌BL-21中為可溶性表達。用鎳層析樹脂純化超聲波上清液，得到34.5mg／m1的高純度蛋白。以純化的重組肉雞HSP70免疫新西蘭大白兔，通過

8、分離免疫血清獲得重組肉雞HSP70的多克隆抗體。免疫印跡分析重組肉雞HSP70的免疫原性。結(jié)果顯示，制備的肉雞HSP70多克隆抗體可以作為肉雞組織中定量HSP70的一種抗體。同時以純化的重組肉雞HSP70免疫BALB／c小鼠，通過淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，獲得2株分泌肉雞HSP70單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，免疫印跡篩選出1株高特異性的肉雞HSP70單克隆抗體(BH70-1),結(jié)果顯示，制備的肉雞HSP70單克隆抗體BH70-1是一種理想抗體。

9、 利用免疫組織化學(xué)間接法和ABC法研究肉雞HSP70在受試雞心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胸腺和法氏囊中的定位分布。試驗結(jié)果顯示，HSP70在熱應(yīng)激受試雞的肺臟、肝臟和心臟的陽性染色最為明顯，陽性信號還顯著分布在這些組織的血管管壁，提示熱應(yīng)激時HSP70可能與心血管系統(tǒng)的損傷和功能有關(guān)。另外，HSP70在肉雞腎臟、脾臟、胸腺和法氏囊都有明顯的分布。通過免疫印跡方法建立肉雞組織中HSPT0的定量方法，以檢測熱應(yīng)激肉雞心臟、肝臟、肺

10、臟，腎臟、脾臟、胸腺、和法氏囊中HSP70的相對含量。試驗結(jié)果顯示，心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胸腺和法氏囊都出現(xiàn)特異性的HSP70和內(nèi)參照GAPDH條帶。 由本試驗結(jié)果得出：肉雞組織中HSC70 mRNA在持續(xù)熱應(yīng)激過程的變化同組織損傷是密切相關(guān)的，可以很好的反映組織的病理損傷過程，初步認(rèn)為可以作為肉雞熱應(yīng)激損傷的標(biāo)志物。肉雞HSP70在持續(xù)熱應(yīng)激過程中主要以抗熱應(yīng)激損傷為主，組織中的mRNA水平在絕大多數(shù)情況下高于對照紐，