基于生物毒價(jià)檢測(cè)和化學(xué)成分分析的毒性中藥附子質(zhì)量評(píng)控研究.pdf

1、中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制是保證中藥安全性、有效性和穩(wěn)定可控性的重要手段，也是保障臨床合理用藥的重要基石。而毒性中藥作用峻烈，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣對(duì)臨床應(yīng)用的影響更大。然而，當(dāng)前以感官評(píng)價(jià)和化學(xué)成分分析為主的質(zhì)控模式主要體現(xiàn)在毒性中藥的真?zhèn)舞b別，不能很好地反映其安全性和有效性，未能擺脫“量而不準(zhǔn)，難關(guān)毒效，難控難評(píng)”的困境。
　　為此，本文以附子為例，從生物毒價(jià)檢測(cè)角度豐富和完善毒性中藥質(zhì)量控制方法體系。建立了基于整體動(dòng)物最小致死量的毒價(jià)測(cè)定法、基

2、于相對(duì)校正因子的6種生物堿含量同時(shí)測(cè)定法以及二萜類生物堿的HPLC-MS/MS檢測(cè)法，并在此方法基礎(chǔ)上開展附子炮制減毒科學(xué)基礎(chǔ)、炮制方法合理性以及探索構(gòu)建“毒性效應(yīng)成分指數(shù)”等方面的應(yīng)用研究，并進(jìn)一步提出增修訂附子商品規(guī)格和質(zhì)量檢測(cè)方法的建議，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂草案，以期為實(shí)現(xiàn)毒性中藥“量而又準(zhǔn)，關(guān)聯(lián)毒效，可控可評(píng)”質(zhì)量評(píng)控愿景提供研究模式和方法學(xué)實(shí)例，為毒性中藥的臨床合理用藥提供參考。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.建立和

3、完善了附子生物毒價(jià)測(cè)定方法
　　本文嘗試建立基于大鼠最小致死量試驗(yàn)的附子生物毒價(jià)測(cè)定方法，以最小致死量、毒效成分轉(zhuǎn)移率以及給藥液的溶血反應(yīng)、滲透壓、有關(guān)物質(zhì)檢查等指標(biāo)，考察了樣品的制備工藝、給藥途徑等關(guān)鍵因素，并取不同炮制品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該法可適用于附子各種炮制品種（可信限率＜15％）。
　　2.建立基于相對(duì)校正因子的6種生物堿含量同時(shí)測(cè)定法
　　采用“一測(cè)多評(píng)”思路和方法，嘗試以一種對(duì)照品同時(shí)測(cè)定6種成分，結(jié)果

4、顯示，以毒性較低的苯甲酰次烏頭堿為內(nèi)參物時(shí)，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿5種成分與其的相對(duì)校正因子在不同儀器、色譜柱和檢測(cè)時(shí)間的重現(xiàn)性均良好，分別為1.039（RSD=1.6%）,1.026（RSD=2.2%）,0.948（RSD=3.7%）,0.957（RSD=1.7%）,0.876（RSD=1.8%）。經(jīng)15批次樣品驗(yàn)證，該法與常規(guī)測(cè)定法的結(jié)果無顯著性差異，故可通過苯甲酰次烏頭堿為對(duì)照同時(shí)測(cè)定6種成分

5、。
　　3.結(jié)合生物毒價(jià)、化學(xué)成分含量、HPLC-MS/MS指紋譜研究結(jié)果，探討了附子炮制減毒的科學(xué)基礎(chǔ)，初步確定了可能的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)
　　從生物毒價(jià)測(cè)定和化學(xué)成分檢測(cè)兩方面入手，比較了生附片和各種炮制附片的毒價(jià)和化學(xué)成分含量差異
　　結(jié)果表明：附子炮制后毒性顯著下降，炮制品的毒價(jià)約為生品的1.0%。與毒價(jià)呈顯著正相關(guān)的7種生物堿為10-羥基烏頭堿、去氧烏頭堿、烏頭堿、10-羥基新烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、3-乙酰烏

6、頭堿。此7種生物堿在炮制品中均顯著下降，其中烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿三種雙酯型生物堿的總量?jī)H為生附片的1.8%～2.6%；而脫水苯甲酰烏頭原堿等環(huán)氧類生物堿、苯甲酰次烏頭原堿等單酯型生物堿、新烏頭原堿等胺醇類物質(zhì)含量顯著增加，其中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿的總量增加4.5～4.6倍（無膽蒸制、炒制附片）或未見顯著性變化（膽制附片），導(dǎo)致三種單酯型生物堿與三種雙酯型生物堿的比值增加39.6～184.9倍。

7、　　上述結(jié)果提示，3-乙酰烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、去氧烏頭堿、10-羥基新烏頭堿、10-羥基烏頭堿為附子的主要毒性物質(zhì)，環(huán)氧類生物堿、單酯型生物堿和胺醇類生物堿可能為藥效物質(zhì)，炮制使前者降解為后者而實(shí)現(xiàn)“減毒存效”效果。
　　4.通過比較毒價(jià)、毒/效物質(zhì)以及無機(jī)雜質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)無膽蒸制附片的“減毒存效”效果優(yōu)于傳統(tǒng)膽制附片
　　比較無膽蒸制、炒制附片與傳統(tǒng)膽制附片在生物毒價(jià)、毒效成分含量以及無機(jī)雜質(zhì)含量三方面的差異

8、，結(jié)果表明：無膽蒸制附片的毒價(jià)和毒性成分含量與傳統(tǒng)膽制附片無顯著性差異；多數(shù)藥效物質(zhì)（12/14）含量顯著高于傳統(tǒng)膽制附片,其中苯甲酰烏頭原堿等三種單酯型生物堿含量增加約6倍；無機(jī)雜質(zhì)含量顯著低于傳統(tǒng)膽制附片。該結(jié)果提示，無膽蒸制工藝的“減毒”能力與傳統(tǒng)膽制工藝相當(dāng)，而“存效”效果優(yōu)于后者，且不會(huì)額外引入無機(jī)雜質(zhì)，非常值得推廣使用。
　　無膽炒制附片的毒價(jià)和毒效物質(zhì)含量均顯著高于傳統(tǒng)膽制附片，其中毒價(jià)約為后者的2倍，苯甲酰烏頭原堿

9、等三種單酯型生物堿含量約增加6倍。該結(jié)果提示，無膽炒制工藝的“減毒存效”效果有待于進(jìn)一步研究。
　　5.初步構(gòu)建了附子的“毒性效應(yīng)成分指數(shù)”
　　為了提高安全性評(píng)控的便捷性和實(shí)用性，本文在毒性成分含量與生物毒價(jià)相關(guān)性研究的基礎(chǔ)上，提出探索構(gòu)建基于主要毒性成分含量綜合加權(quán)的生物毒價(jià)預(yù)估值——“毒性效應(yīng)成分指數(shù)”，并初步構(gòu)建了附子的“毒性效應(yīng)成分指數(shù)”預(yù)估模型。經(jīng)驗(yàn)證，該模型可用于預(yù)估附子的生物毒價(jià)。
　　6.整合上述研究

10、結(jié)果，提出附子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂建議，并制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案
　　根據(jù)附子質(zhì)量評(píng)控方法的對(duì)比研究、毒性物質(zhì)基礎(chǔ)和無膽炮制方法的合理性探討結(jié)果，建議修訂商品規(guī)格、質(zhì)量檢測(cè)方法，即：①規(guī)格中增加無膽蒸制附片；②【檢查】項(xiàng)修訂雙酯型生物堿限量檢查法；③【含量測(cè)定】項(xiàng)修訂單酯型生物堿含量測(cè)定法；④增加【生物毒價(jià)測(cè)定】項(xiàng)。
　　綜上所述，本文建立了生物毒價(jià)測(cè)定方法和“毒性效應(yīng)成分指數(shù)”模型，結(jié)合化學(xué)成分分析法，提升了評(píng)控毒性中藥附子安全性的質(zhì)量