T4對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷腦組織缺氧誘導因子-1α表達的調節(jié)及機制.pdf

1、研究背景與目的：
　　新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)，定義為發(fā)生于圍產期的窒息所引起的缺氧、腦血流減少或短期腦血流灌注中斷所致的腦缺氧缺血性損傷，呈現(xiàn)一系列中樞神經異常的臨床癥狀與體征，是引起急性圍生期死亡和遠期神經系統(tǒng)后遺癥的重要原因之一。因此，缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)的防治策略和干預機制一直以來是臨床

2、醫(yī)生和研究人員關心的問題。在新生兒缺氧缺血性腦損傷時，一系列基因轉錄活化從而引發(fā)保護性或有害性反應，其中保護性的反應包括刺激紅細胞生成、抗凋亡及血管形成等，有害性的反應包括凋亡和壞死，介導這些基因轉錄的一個關鍵因子是缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)。生理情況下，HIF-1α參與了早期腦發(fā)育和神經元祖細胞的增殖。在HIBD時，HIF-1α蛋白穩(wěn)定性增加，并和HIF-1β二聚體化形成

3、HIF-1，隨后作用于靶基因缺氧反應元件調控血管內皮生長因子、葡萄糖載體蛋白-1、促紅細胞生成素等的表達而發(fā)揮腦保護作用。所以，探尋上調HIF-1α表達的藥物，將為HIE提供一個重要的治療靶向。有研究表明，部分中、重度HIE存在著甲狀腺功能減低，使用左甲狀腺素片干預可促使HIE的恢復。迄今為止，國內未見甲狀腺素(thyroxine，T4)影響HIF-1α表達的研究，國外T4對HIF-1α表達影響的研究較少，并且研究對象多為體外的細胞，牽

4、涉到的機制多為甲狀腺素可以通過激活三磷酸肌醇激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/Akt，PI3K/Akt)信號通路，使磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)表達增加，進而促進HIF-1α表達。然而國內外均未見在HIBD腦組織中有T4對HIF-1α表達影響及其相關機制的報道。本實驗通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，甲狀腺素作為干預藥物，檢測大鼠腦組織內的HIF-1α蛋白、mRNA及p-Akt蛋白表達。旨在探

5、討T4對新生大鼠HIBD腦組織HIF-1α表達的影響及可能的作用途徑，為臨床上應用T4干預HIE提供動物實驗證據。
　　材料和方法：
　　64只健康7日齡清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，體質量12～16g，按隨機原則分為:假手術組、模型對照組(M)、溶劑干預組和T4干預組(T4)，每組分別有16只（即n=16）。
　　模型對照組:首先鈍性分離并結扎新生大鼠左邊的頸總動脈，放回母鼠旁1小時后，把

6、新生大鼠放入自制的有機玻璃缺氧艙中，充以氮氧混合氣(92％N2、8％O2)，時間為2小時;假手術組:僅僅鈍性分離左側的頸總動脈，但不進行后續(xù)的結扎及缺氧處理;從HIBD模型制作成功后的當日開始，T4干預組和溶劑干預組均通過腹腔注射的干預方式，分別給予2ug/100gT4溶液和相同體積溶劑（指溶解甲狀腺素粉末所需的堿性乙醇溶劑，具體見正文部分的甲狀腺素溶液的配備），每天1次，一共5天。
　　各組大鼠飼養(yǎng)至P11（出生當天記為P0）時

7、，每組隨機均取8只，經乙醚吸入方式，適度麻醉后，從左心室先后灌注約40mL生理鹽水及約40ml40g/L的甲醛，然后開顱取腦，再用40g/L甲醛室溫條件下固定24～48h，隨后進行脫水和透明，然后石蠟包埋，接著切片，切片厚度取3μm，行免疫組化檢測所有組大鼠腦組織中p-Akt和HIF-1α的蛋白表達情況;每組另外隨機各取8只，經乙醚吸入麻醉之后，開顱取腦，在冰袋上快速的分離左側的新生大鼠的腦皮質，迅速置入液氮，以備RT-PCR用，檢測所

8、有組的新生大鼠左邊的腦皮質內HIF-1αmRNA表達情況。
　　結果：
　　1、免疫組化結果顯示:HIF-1α及p-Akt蛋白細胞分布主要在腦皮質和海馬的神經細胞，他們在細胞內的具體定位不同，其中，HIF-1α多數(shù)在細胞核，少數(shù)在細胞質，而p-Akt主要在神經元的胞漿內和胞膜上。
　　2、假手術組大腦皮質p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達水平依次為8.080±0.369、38.581±2.846

9、，0.174±0.015;模型對照組缺血側大腦皮質p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達水平依次為50.168±4.259、72.795±6.121、0.448±0.035;溶劑干預組大腦皮質p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達水平依次為52.199±3.850、78.481±5.080、0.439±0.035;上述p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達水平，模型對照組較假手

10、術組升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，而模型對照組與溶劑干預組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　3、T4干預組缺血側大腦皮質p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達水平依次為82.765±6.271、117.350±9.374及0.618±0.042，較模型對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　4、在模型對照組及T4干預組，HIF-1α與p-Akt蛋白的表達水平均呈