胱硫醚γ-裂解酶-硫化氫在脂多糖誘導大鼠肝細胞凋亡中的作用及機制.pdf

1、目的:探討脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導大鼠肝細胞胱硫醚γ-裂解酶-硫化氫(cystathionineγ-lysae-hydrogen sulfide，CSE-H2S)體系的規(guī)律性變化;查明CSE來源的H2S在LPS誘導的肝細胞凋亡中的作用，探討內(nèi)源性H2S參與肝細胞凋亡的相關(guān)機制。
　　 方法:大鼠肝細胞系BRL細胞培養(yǎng)，用CSE siRNA應用于正常培養(yǎng)的BRL細胞、LPS處理的BRL細胞。用RT

2、-PCR、Western blot檢測CSE的基因和蛋白表達變化，用去蛋白法檢測細胞內(nèi)源性H2S生成量變化;生化方法檢測細胞上清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性、細胞丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、細胞還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量以及MTT細胞生長抑制率變化;用流式細胞術(shù)、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率變化;熒光顯微鏡檢測線粒體膜電位(

3、mitochondrialmembrane potential，MMP)變化;Western blot檢測細胞色素C(CytochromeC，Cyt C)、caspase-3激活體蛋白(cleaved Caspase-3)表達變化。
　　 結(jié)果:1、大鼠肝細胞系BRL細胞在正常培養(yǎng)條件下存在著CSE基因、蛋白表達以及內(nèi)源性H2S生成;CSE siRNA引起B(yǎng)RL細胞CSE蛋白表達下調(diào)，內(nèi)源性H2S生成明顯減少;與Negative

4、 control組比較，CSEsiRNA轉(zhuǎn)染BRL細胞4-24h，BRL細胞上清LDH活性、細胞MDA含量、細胞GSH含量、MTT細胞增殖活力及細胞凋亡率均無明顯影響。2、隨著LPS作用時間延長(0～24h)及LPS作用濃度(0.1～100μg/ml)升高，CSE基因、蛋白表達明顯上調(diào)，內(nèi)源性H2S生成呈時間依賴性和劑量依賴性明顯增多;細胞凋亡比率上升，細胞MMP降低，胞漿Cyt C、caspase-3激活體蛋白表達上調(diào);BRL細胞上清

5、LDH活性增加，細胞MDA含量上升，細胞GSH含量在8h上調(diào)，12h、24h下降，MTT細胞生長抑制率在8h下調(diào)，12h、24h上升。3、CSE siRNA與LPS共同作用BRL細胞，與LPS單獨作用組相比，BRL細胞凋亡率在4h上升，8h無顯著性差異，12h、24h明顯下降;細胞MMP在4h下降，8h無顯著性差異，12h、24h明顯上升;胞漿Cyt C、caspase-3激活體蛋白表達在4h上升，8h無顯著性差異，12h、24h明顯下