硫化氫在PI3k-Akt通路對(duì)大鼠肝細(xì)胞增殖、凋亡的作用中的影響.pdf

1、目的：
　　探討硫化氫（H2S）對(duì)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞增殖、凋亡的影響，研究PI3K/Akt信號(hào)通路在H2S影響肝纖維化大鼠肝細(xì)胞(HC)的增殖、凋亡中的作用，探討H2S是否通過 PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的增殖、凋亡及膠原蛋白的表達(dá)，從而延緩肝纖維化的發(fā)生。
　　方法：
　?。?）采用40％四氯化碳棉籽油背部皮下注射聯(lián)合高脂肪高膽固醇飼料及酒精的復(fù)合因素法建立肝纖維化大鼠模型。（2）采用胰酶兩步灌流法提取肝纖維

2、化大鼠的肝細(xì)胞。（3）提取的原代肝細(xì)胞用MTT法測(cè)定NaHS和LY294002對(duì)大鼠肝細(xì)胞的增殖抑制率（IR），分對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組按照加藥濃度梯度分組：NaHS組分別按照25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L、200μmol/L濃度梯度給藥，LY294002組分別按照25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的濃度梯度給藥，均干預(yù)48小時(shí)，加入MT

3、T20μl暗處反應(yīng)4小時(shí)，加入DMSO150μl終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀于570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（A）值。（4）Hoechst33342染色檢測(cè)H2S與 LY294002對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響：分4組，正常對(duì)照組（ N）、NaHS50μmol/L組（ S）、LY29400250μmol/L+NaHS50μmol/L組(LYS)、LY29400250μmol/L組(LY)，倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算肝細(xì)胞的凋亡率。（5）western-b

4、lot檢測(cè)PI3k、Phospho-bad蛋白的表達(dá)量：分4組，正常對(duì)照組（N）、NaHS50μmol/L組（S）、LY29400250μmol/L+NaHS50μmol/L組(LYS)、LY29400250μmol/L組(LY)，計(jì)算目的蛋白灰度值與β-actin蛋白灰度值的比值。（6）PCR法檢測(cè)肝細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)：分4組，正常對(duì)照組（N）、NaHS50μmol/L組（S）、LY29400250μmol/L+NaHS

5、50μmol/L組(LYS)、LY29400250μmol/L組(LY)，提取肝細(xì)胞中總RNA，PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　50μmol/LNaHS，50μmol/LLY294002為最適濃度；與對(duì)照組相比，NaHS+LY294002組細(xì)胞凋亡率高（P<0.05），NaHS組細(xì)胞凋亡率低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NaHS組PI3k、Phospho-bad蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組和NaHS+LY

6、294002組，而NaHS+LY294002組PI3k、Phospho-bad蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組和NaHS組，各組間相互比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；NaHS組I、III型膠原mRNA表達(dá)量最高（P<0.05），但 I型膠原 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LY組 I、III型膠原mRNA表達(dá)量最低，條帶最暗，差異與各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），NaHS+LY組膠原表達(dá)量較LY組高，較對(duì)照組和NaHS組